01 研究背景
视网膜母细胞瘤蛋白（RB）是首个被分子鉴定的肿瘤抑制蛋白。其经典功能是在细胞周期G1期，通过结合并抑制E2F转录因子家族，阻止促进细胞增殖的基因表达。当细胞接收到生长信号时，周期蛋白依赖性激酶（CDK）磷酸化RB，使其失活并释放E2F，从而驱动细胞进入S期。这一“RB-E2F”轴是细胞周期调控的核心环节。随着研究的深入，人们发现RB可能具有超越调控E2F的“非经典”功能。此前的研究已观察到RB可与不同类型的顺式调控元件（如增强子和绝缘子）结合，且RB对细胞核形态有影响，但RB是否通过调节染色质三维结构（特别是黏连蛋白依赖的DNA loop）来行使非经典转录调控功能尚不明确。
2026年4月，美国麻省总医院癌症中心和哈佛医学院（Massachusetts General Hospital Cancer Center and Harvard Medical School）研究团队于Nature Communications发表题为“RB loss modulates chromatin organization by regulating cohesin-dependent loops and enhancer-promoter interactions”的研究成果。该研究采用Micro-C和HiChIP技术，系统研究了RB在染色质三维组织中的新角色，揭示了一个此前未报道的RB功能：它通过促进黏连蛋白（Cohesin）从绝缘子位点释放，来减少TAD边界的绝缘作用，从而增强增强子-启动子互作，最终激活数百个非E2F靶基因的表达。
图1 文章信息和机制模式图
02 研究设计与方法概述
2.1 核心实验模型：hTERT‑RPE1人视网膜色素上皮永生化细胞。
2.2 实验分组：两种互补的干预策略
为了区分RB在细胞周期调控和染色质结构调控中的作用，研究设计了两组实验：
实验组1：持续活化型RB过表达（RBΔCDK）。用多西环素诱导表达一种不能被CDK磷酸化的、持续活跃的RB突变体（RBΔCDK ）；处理24h细胞停滞于G0/G1期，72h永久退出细胞周期并出现染色质弥散，用于探究非磷酸化RB对核结构、染色质的影响。
实验组2：RB长期缺失（RBKO）。使用CRISPR/Cas9技术敲除RB1基因；先通过接触抑制使细胞同步在G1期，再经胰酶处理释放进入S期，用来区分RB本身功能与细胞周期改变对染色质结构的不同作用。
2.3 组学技术：Micro-C、HiChIP（H3K27ac）、ChIP-seq（黏连蛋白核心亚基SMC3、CTCF、RB、E2F1、各种组蛋白修饰）、ATAC-seq、RNA-seq、scRNA-seq。
03 研究结果
3.1 RB是染色质组织的全局调节因子
关于RB活性增加（RB-CDK）的影响，Micro-C分析显示，表达持续活跃的RB导致远距离染色质接触概率（s > 3 Mb）发生明显变化，具体表现为B compartment（通常代表异染色质）向邻近区域扩散，并且B compartment内部空间距离增加。这与显微镜下观察到的“异染色质分散表型”相一致，证实了RB活性增强会重塑核区隔。关于RB缺失（RBKO）的影响，相反，在G1期同步的细胞中，RB缺失主要影响短距离染色质互作。这一尺度正是黏连蛋白依赖的DNA loop形成的尺度。具体而言，RBKO导致接触概率衰减曲线更陡峭，表明DNA loop的形成发生了改变。
RB缺失使黏连蛋白依赖的DNA loop数量增加了40.5%，且loop的平均长度增加了约16.4 kb。同时，TAD边界的绝缘强度（Insulation score）在RBKO细胞中显著增强。这些变化在S期细胞中并不明显，说明此效应是G1期特异的。RB在G1期负调控黏连蛋白依赖的DNA loop的形成和大小。
图2 G1期RB缺失特异性改变黏连蛋白依赖的loop数量、loop大小及TAD边界强度
3.2 RB和黏连蛋白在全基因组层面共定位
研究通过ChIP-seq发现，RB的结合位点与SMC3（黏连蛋白）的结合位点在基因组上高度重叠。这种重叠在CTCF结合的绝缘子位点最为显著，超过99%的RB结合绝缘子也结合SMC3。与启动子（Promoter）和增强子（Enhancer）相比，绝缘子上的RB与SMC3共定位程度最高。此外，RB结合区域的染色质开放性（ATAC-seq信号）和绝缘强度均高于非RB结合区域。RB与黏连蛋白在染色质上（尤其是CTCF绝缘子位点）存在明确的物理空间共定位，提示RB可能直接参与调节黏连蛋白在该处的功能。
图3 RB结合的染色质位点同时存在黏连蛋白组分SMC3，且该区域染色质绝缘性增强
3.3 RB促进黏连蛋白从CTCF位点释放
该研究检测了不同细胞周期阶段（G1、S、M期）的SMC3结合情况。在M期（有丝分裂期），正常情况下，黏连蛋白会在前中期从染色体臂上被大量移除。然而，在RB缺失的细胞中，这种移除过程受到阻碍。在同步于前中期的RBKO细胞中，SMC3在CTCF绝缘子位点的结合信号平均增加了57.6%。在G1期，这种“多余的”黏连蛋白结合没有被完全清除，而是持续保留到G1期。G1期RBKO细胞中，绝缘子上的SMC3信号依然高于野生型。同时，研究观察到在RBKO细胞中，位于绝缘子之间的非SMC3结合区域（即正在被挤压的DNA loop内部）的SMC3信号反而下降。这支持了一个模型：RB缺失导致黏连蛋白“卡”在CTCF锚点上，无法正常释放和解离。RB的正常功能是促进黏连蛋白在M期从CTCF绝缘子位点释放，此效应会延续至G1期；RB缺失则导致黏连蛋白在绝缘子处异常滞留。
图4 RB可促进黏连蛋白从CTCF绝缘子位点脱离
3.4 RB缺失导致TAD边界绝缘增强，减弱增强子-启动子互作
黏连蛋白在CTCF位点的滞留直接影响了TAD边界的功能。通过计算绝缘分数（Insulation score），研究发现SMC3信号增加最多的区域，其绝缘分数也增加最多，意味着TAD边界变得更加“坚固”。
为了探究对转录调控的直接影响，该研究进行了H3K27ac HiChIP实验。结果显示，在RBKO细胞中，H3K27ac标记的远距离互作（Peaks）数量减少了3.3倍，且互作强度整体减弱。
进一步分类发现，无论是增强子-增强子、增强子-启动子还是启动子-启动子互作，其强度在RB缺失后均下降。这种下降在跨越TAD边界的互作（Inter-TAD）上表现得更为显著。RB缺失导致的TAD边界绝缘增强，物理上阻碍了活跃增强子与启动子之间的有效接触。
图5 RB缺失减少了远端增强子-启动子相互作用
3.5 RB通过此机制激活非E2F靶基因
该研究筛选出一组基因，其活性增强子和启动子之间存在一个或数个绝缘子。在这些基因中，由于RB缺失导致绝缘子上黏连蛋白增加（Cohesin gain），其表达量显著低于平均水平，也显著低于那些绝缘子上黏连蛋白减少（Cohesin loss）的基因。基因集富集分析（GSEA）显示，受此机制调节的基因主要参与上皮间质转化（EMT）和细胞外基质组织。功能验证显示，RBKO细胞在G1期的贴壁能力下降（脱落率升高）、迁移能力增强（划痕愈合实验）。这与前述基因表达谱的变化（EMT相关基因改变）一致。聚类分析显示，RB作为转录激活因子促进的基因（Cluster 5），其中有54.5%属于“黏连蛋白增加”基因集。RB通过促进绝缘子上黏连蛋白的释放，增强增强子-启动子互作，从而激活了数百个非E2F靶基因的表达。这些基因涉及维持上皮细胞特征等生物学过程。
图6 RB缺失会降低不结合E2F、且与黏连蛋白富集型绝缘子相关的基因表达
04 小结
本研究使用高分辨率Micro-C分析RB对染色质结构的影响，并结合HiChIP直接量化特定类型调控元件的互作，这在RB研究中较为少见。首次在分子层面证实了RB不仅能作为转录抑制子（通过E2F），还能作为转录激活子，且其激活机制是全新的——通过调节三维染色质结构来实现。这为理解RB失活导致的肿瘤表型（如转移、谱系转型）提供了新的解释框架。研究发现RB介导的黏连蛋白释放主要发生在有丝分裂期，但其效应会持续到G1期。这有别于经典的“激酶磷酸化”调控模式，揭示了一个从有丝分裂到G1期的“记忆”机制，即RB在M期的活动决定了G1期的染色质状态。对于肿瘤生物学，该发现为解释RB1突变肿瘤为何具有高转移性、以及为何对某些治疗产生耐药提供了机制线索。靶向染色质结构（如靶向黏连蛋白）可能是治疗RB缺失肿瘤的潜在策略。
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参考文献
Lee H, Gkotinakou I M, McGrath C G, et al. RB loss modulates chromatin organization by regulating cohesin-dependent loops and enhancer-promoter interactions[J]. Nature Communications, 2026.
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