摘要
髓母细胞瘤（MB）是儿童中最常见的恶性脑肿瘤，具有临床和基因组异质性。在四个主要亚组中，3组肿瘤（MYC-MB）表现出高水平的MYC和转移率。尽管接受了手术、放疗和化疗，3组髓母细胞瘤患者更易发展为具有高度侵袭性的复发性肿瘤，且生存率较差。为研究本研究中的耐药机制，我们对配对的原发性和复发性肿瘤进行了单核多组学分析。治疗耐药的髓母细胞瘤表现出扩增的持续祖细胞群。此外，不同的染色质景观与转录改变相关，并与代谢重编程相对应。体内辐射耐药模型显示出类似的基于染色质的代谢重编程，其焦点是野生型异柠檬酸脱氢酶（IDH1）活性。IDH1抑制可逆转由耐药引起的染色质变化，并使肿瘤重新对辐射敏感。最终，这些发现证明了单细胞多组学分析在阐明耐药机制和识别MYC驱动型髓母细胞瘤可靶向通路方面的有效性。
数据收集
GSE283621
bulk RNA sequencing：GSE119926
数据库与资源整理
资源名称 | 描述 | 链接/标识符 |
|---|---|---|
| GEO (Gene Expression Omnibus) | 本研究产生的所有单细胞RNA-seq和ATAC-seq原始及处理数据的存储库。 | 登录号GSE280306 |
| UCSC Cell Browser | 提供本研究单细胞数据的交互式可视化平台，可在线探索细胞分群和基因表达。 | 项目专属访问链接 |
| cBioPortal | 可能包含本研究中涉及的批量RNA-seq或遗传变异数据（如有）的临床基因组学分析平台。 | (需根据论文补充信息确认具体数据集) |
| DepMap | 可用于查询PC或HDAC家族基因在癌细胞系中的依赖性，辅助靶点验证。 | Portal |
实验方法
实验方法总结
方法类别 | 具体方法 | 样本/模型 | 主要目的 | 关键技术参数/条件 |
|---|---|---|---|---|
| 样本收集 | 患者肿瘤组织活检 | 23例新诊断、19例配对复发MB患者组织 | 获取真实临床样本 | SHH和Group3亚型，配对样本设计 |
| 组织处理 | 肿瘤组织解离 | 新鲜/冷冻肿瘤组织 | 制备单细胞悬液 | 酶解+机械解离，活细胞分选 |
| 单细胞测序 | 10x Genomics单细胞RNA测序 | 单细胞悬液 | 获取转录组图谱 | Chromium平台，~10,000细胞/样本 |
| 单细胞测序 | 10x Genomics单细胞ATAC测序 | 单细胞悬液 | 获取表观基因组图谱 | Chromium单细胞ATAC试剂盒 |
| 多组学整合 | CITE-seq（细胞表面蛋白检测） | 部分单细胞悬液 | 蛋白表达验证 | 抗体标记，与scRNA-seq同步 |
| 计算分析 | 单细胞数据预处理 | 测序原始数据 | 质量控制与标准化 | CellRanger流程，Seurat v4 |
| 计算分析 | 细胞聚类与注释 | 单细胞表达矩阵 | 识别细胞类型与状态 | UMAP降维，marker基因鉴定 |
| 计算分析 | 多组学数据整合 | scRNA-seq + scATAC-seq数据 | 关联表观与转录变化 | Signac工具包，共嵌入分析 |
| 计算分析 | 代谢通路分析 | 单细胞转录组数据 | 量化代谢活性 | scMetabolism R包，通路富集评分 |
| 计算分析 | 调控网络推断 | 单细胞多组学数据 | 识别关键转录因子 | SCENIC分析，调控网络重建 |
| 功能验证 | 细胞培养 | MB细胞系（DAOY, UW228等） | 建立体外模型 | 标准培养基，37°C，5% CO₂ |
| 功能验证 | shRNA敲低实验 | MB细胞系 | 验证基因功能 | 慢病毒转导，puromycin筛选 |
| 功能验证 | 小分子抑制剂处理 | MB细胞系 | 评估药物敏感性 | HDAC抑制剂（Panobinostat等） |
| 功能验证 | 细胞增殖检测 | 处理后的MB细胞 | 评估生长抑制 | CCK-8/MTS法，连续监测 |
| 功能验证 | 细胞凋亡检测 | 处理后的MB细胞 | 评估细胞死亡 | Annexin V/PI流式细胞术 |
| 功能验证 | 代谢分析 | MB细胞系 | 检测代谢表型 | Seahorse细胞能量代谢分析仪 |
| 功能验证 | 蛋白质印迹 | 细胞/组织裂解物 | 验证蛋白表达 | SDS-PAGE，目标抗体检测 |
| 功能验证 | 染色质免疫沉淀 | 细胞/组织样本 | 验证组蛋白修饰 | H3K27ac ChIP-qPCR/seq |
| 功能验证 | 动物模型建立 | PDX小鼠模型 | 体内验证 | NOD/SCID小鼠，肿瘤原位移植 |
| 功能验证 | 体内药效评价 | PDX小鼠模型 | 评估治疗效果 | PC抑制剂/HDAC抑制剂治疗 |
| 功能验证 | 组织学分析 | 小鼠肿瘤组织 | 病理学评估 | H&E染色，免疫组化（IHC） |
| 统计分析 | 差异表达分析 | 单细胞/批量数据 | 识别差异基因 | Wilcoxon检验， |
| 统计分析 | 生存分析 | 患者临床数据 | 评估预后价值 | Kaplan-Meier曲线，log-rank检验 |
| 统计分析 | 相关性分析 | 多组学数据 | 评估关联性 | Pearson/Spearman相关分析 |
| 数据可视化 | 图形生成 | 分析结果 | 结果展示 | ggplot2，ComplexHeatmap等 |
软件使用
软件包列表
工具/软件 | 用途领域 | 主要功能描述 |
|---|---|---|
| Cell Ranger | 单细胞测序数据处理 | 对10x平台产生的scRNA-seq和scATAC-seq原始数据进行比对、计数矩阵生成。 |
| Seurat (R包) | 单细胞RNA-seq分析 | 单细胞数据的标准分析流程：质控、标准化、降维（PCA/UMAP）、聚类、差异表达分析、细胞注释。 |
| ArchR (R包) | 单细胞ATAC-seq分析 | 专门用于scATAC-seq数据的分析：识别染色质可及性峰、降维、聚类、构建基因活性矩阵、识别差异可及区域。 |
| Signac (R包) | 单细胞多组学整合 | 整合分析scRNA-seq和scATAC-seq数据，实现联合聚类、共嵌入可视化、以及连接调控元件与靶基因。 |
| SCENIC (R包) | 调控网络推断 | 基于共表达和顺式调控元件分析，推断单细胞水平的转录因子调控网络及其活性。 |
| scMetabolism (R包) | 单细胞代谢分析 | 量化评估单个细胞中代谢通路的活性，用于发现代谢异质性和重编程。 |
| AUCell (R包) | 基因集活性评分 | 通过计算特定基因集在单个细胞中的表达富集程度，来评估通路或生物学过程的活性。 |
| ComplexHeatmap (R包) | 数据可视化 | 生成高质量的统计图形和热图。 |
| DESeq2 / edgeR (R包) | 差异表达分析 | 用于批量RNA-seq数据的差异基因表达分析（可能用于验证或补充分析）。 |
| Prism / FlowJo | 统计分析与流式数据处理 | 用于体外和体内实验数据的统计分析及流式细胞术数据分析。 |
统计方法列表
研究成果
1.匹配的原发性和复发性髓母细胞瘤的scMultiome测序
A scMultiome的匹配原发肿瘤和复发肿瘤处理示意图。
B 基于FindClusters算法对20个聚类进行细胞状态命名。
C 12个主要聚类的合并细胞状态。
D 患者原发肿瘤（n=3）和复发肿瘤样本（n=3）的sn基因表达标记点图。
E 12个主要聚类和20个次要聚类中的细胞比例。按细胞类型着色。
F 患者原发肿瘤（n=2）和复发肿瘤（n=2）组3肿瘤的Xenium原位空间转录组分析。
G 原发肿瘤（n=3）和复发肿瘤（n=3）群体中前10个富集通路的fGSEA点图。
H 来自祖细胞-光感受器细胞状态、循环神经祖细胞状态和中间神经元/神经元细胞状态的代表性UMAP标记基因表达。
2.复发性肿瘤中染色质可及性的改变调控网络编程
A 两尾皮尔逊相关性分析，比较峰可及性与差异表达基因。
B 染色质可及性矩阵，按细胞状态展示基因表达标记物。
C 火山图展示了原发与复发肿瘤细胞中差异峰可及性。
D 通过 GREAT 确定的获得性峰的功能富集。
F 按细胞状态的峰可及性轮廓，具有代表性基因和 HLX）的近端基因连接，这些基因代表原发肿瘤和复发肿瘤中变化的细胞状态。
G 原发与复发中前十位基因调控网络。基因网络关联的显著性报告。
H 按细胞状态的前五位活跃基因调控网络的点图。
3.伪时间分析将细胞状态进展投射到复发性肿瘤中
A 主要肿瘤细胞状态的伪时间排序。
B 双分支细胞轨迹上的复发肿瘤细胞状态。
C 基于分支表达分析建模的分支依赖基因层次聚类表达热图。
D 复发肿瘤。伪时间方向从分支前开始，沿细胞命运1或细胞命运2进行。
E 主要肿瘤标记基因沿伪时间轨迹的ATAC可及性评分和基因表达。
F 复发肿瘤标记基因沿伪时间轨迹的ATAC可及性评分和基因表达。
4.祖先后裔光感受器基因特征与3组类型肿瘤及复发转移病灶一致
A 对Cavalli数据集进行GSVA分析。
B Kaplan-Meier生存曲线显示所有组髓母细胞瘤中高表达和低表达祖细胞-光感受器基因特征的两组结果。
C 所有髓母细胞瘤亚组中祖细胞-光感受器基因特征的Cox回归分析
D Okonechnikov数据集原发肿瘤与复发肿瘤的差异基因表达火山图。
E 基因特征热图比较Okonechnikov数据集中组3和组4原发和复发肿瘤。
F Kaplan-Meier生存曲线显示所有组。
G 类似祖细胞-光感受器群体的抗性细胞发展为复发的模型。
5.辐射抗性的体内模型
A 辐射抗性模型开发示意图。
B 控制肿瘤和辐射抗性肿瘤的UMAP可视化。
C 基于ORA GSEA的聚类细胞分组。
D 各聚类中前10个差异表达基因的热图
E 基于单个聚类的过度表示分析热图。。
F 将辐射抗性肿瘤与对照组进行GSEA比较。
G PDX411辐射抗性肿瘤和411FH对照组的UMAP可视化。
H PDX411辐射抗性肿瘤和411FH对照组的UMAP上祖细胞-感光细胞基因特征表达
I 辐射抗性肿瘤与对照组的祖细胞-感光细胞基因特征表达小提琴图。
J PDX411肿瘤中各聚类前3个差异表达基因（DEGs）的热图。
K 聚类6中前100个基因的功能基因组学分析。
L 与获得性峰相关的基因组区域的功能富集。
M 辐射抗性肿瘤和对照组的ATAC-seq聚类UMAP可视化。
6.抑制IDH1会抑制增殖并改变代谢途径
A 放射抵抗型与敏感型细胞间的层次聚类热图。采用欧几里得距离计算。
B 放射抵抗型与敏感型细胞相比的代谢物富集汇总过度表示分析。
C IDH1 敲低的髓母细胞瘤细胞系中的神经球实验生长情况。
D IDH305、GSK321 和 IDH1−13 对 D458、D425 敏感型及 D458IR、D425IR 细胞系的 Log IC50 确定。
E D458、D458IR、D425、D425IR 细胞经 IDH305处理后的α-酮戊二酸测定箱线图。
F D458、D458IR、D425、D425IR细胞经DMSO或IDH305处理后 ALDH+ 细胞的散点图。
G D458IR和D425IR细胞经 IDH305或 GSK321处理后的极限稀释实验
H 生存分数图。
I D458IR细胞经DMSO、IDH1−13、α-KG 或联合处理后的神经球生长实验。
J 谷氨酰胺生成柠檬酸的模型。
K 标记的13C5, 15N2 L-谷氨酰胺散点条形图
7.IDH1抑制通过恢复辐射抗性细胞的亲代表观遗传谱型
A 实验示意图。
B H3K4me3、H3K27ac和H3K27me3在转录起始位点（TSS）上游3Kb至下游3Kb区域的轮廓热图。
C 注释：与D458相比，D458IR中H3K27ac、H3K4me3和H3K27me3峰占有率增加和减少的百分比。
D 概述H3K4me3、H3K27ac和H3K27me3在启动子及远端基因间区和内含子区域的峰占有率变化。
E （F和G）的示意图表示。
H 散点图显示D458IR/D458的H3K4me3 Log2FC比值与H3K27me3的比较。
I 双占据H3K4me3/H3K27me3峰的基因集富集分析。富集的显著性报告。
J 散点图显示D458IR+IDH1i/D458IR的H3K4me3 Log2FC与H3K27me3的比较。
K 前体光感受器特征代表性基因位点的基因组浏览器视图。
8.IDH1抑制可延长体内生存期并减少肿瘤生长。
A 放射治疗和IDH1−13治疗方案的异种移植及侧位体内研究。
B D458IR shIDH1和shNull异种移植小鼠以及D458IR shIDH1+IR和shNull+IR的Kaplan-Meier生存曲线。
C Vehicle、IDH1−13组、Vehicle+IR和IDH1−13+放疗组肿瘤体积的箱线图。
D 肿瘤图像，单位为厘米和毫米。
E Vehicle、IDH1−13、车辆+放疗组和IDH1−13+放疗组肿瘤重量的箱线图。
Reference
Veo, B., Wang, D., DeSisto, J. et al. Single-cell multi-omics identifies metabolism-linked epigenetic reprogramming as a driver of therapy-resistant medulloblastoma. Nat Commun 16, 10470 (2025).
