在生物工程实验室与中试生产线中，重组蛋白的表达和纯化是核心单元操作，工艺参数的精准标定、设备工况的匹配度，直接决定产品合格率、生产能耗与原料利用率。牛肠激酶轻链作为常用工具酶，在大肠杆菌表达体系中极易形成包涵体，这是工艺调试阶段的高频难题。过往调试过程中，即便更换 Trx、GST 等融合标签、调整诱导温度与试剂浓度，依旧无法实现稳定的可溶性表达；而切换至真核表达系统后，又出现发酵罐产能不足、层析设备负荷不匹配等工程问题。同时，包涵体对应的变性、复性工序会增加设备运维压力，纯化环节参数紊乱还会导致成品纯度不达标。为解决以上工程难题，本文以重组牛肠激酶轻链为案例，采用双 SUMO 串联促溶标签，逐一对表达、酶切、层析全流程完成参数标定，梳理一套标准化的重组蛋白的表达和纯化调试方案，详细记录设备运行参数、试剂配比与工况要求，为同类型工艺开发提供工程参考。![]()
结合工程实操经验，拆解重组蛋白的表达和纯化四大调试难点。第一，表达单元参数联动问题。肠激酶轻链含多对二硫键，大肠杆菌胞内氧化环境不足，二硫键错配引发聚集；诱导温度、IPTG 浓度、培养时长三大参数相互制约，温度过高、诱导剂浓度偏大，蛋白表达速率过快，折叠不充分，包涵体增多；温度过低则菌体生长缓慢，整体产能下降。第二，融合标签适配问题。传统单 SUMO、Trx 标签促溶能力有限，无法彻底解决蛋白聚集，标签选择失误会导致前期载体构建、菌种培养全部返工。第三，酶切单元参数管控难点。Ulp1 酶切割 SUMO 标签时，酶切比例、反应温度、反应时长会直接影响切割效率，比例过高增加生产成本，比例过低则标签切除不完全，影响后续纯化效果。第四，层析单元设备参数调试。阴离子交换柱、镍亲和柱的柱床平衡、流速、上样量、洗脱梯度等参数偏差，会造成目标蛋白流失、杂蛋白去除不彻底，最终成品纯度无法达标。针对以上工程痛点，本次调试遵循 “先优化表达、再标定酶切、最后固化层析参数” 的顺序，分步完成全流程重组蛋白的表达和纯化工艺定型。
本次调试使用实验室标准生物工程设备，全程模拟中试生产线单元操作。核心设备包括恒温振荡培养箱、工业超声破碎仪、ÄKTA pure 25 蛋白纯化系统、Capto Q 阴离子交换柱、Ni-NTA 镍亲和层析柱、圆二色谱仪、荧光分光光度计、多功能微孔板检测仪。试剂采用工业通用缓冲液、IPTG、Ulp1 酶、咪唑等常规耗材，宿主菌株选用适配二硫键折叠的 OrigamiB (DE3) 大肠杆菌。前期完成载体构建与工程菌验证，确认 2SUMO-rbEK-His 重组质粒序列无误后，正式启动参数梯度调试，每组参数设置 3 组平行样本，记录设备运行数据，采用统计学分析确保参数具备复用性。
首先完成表达单元参数标定，核心目标是实现蛋白可溶性表达与产能平衡。菌种扩增参数：一级种子液 37℃、200 r/min 培养 12~14 h，转接比例 10%，二级发酵液同温度转速培养 4 h。诱导参数梯度调试：IPTG 浓度设置多组梯度，最终确定最优浓度 50 μmol/L；诱导温度对比 20℃、25℃、30℃，25℃条件下蛋白可溶性与表达量综合最优；诱导时长梯度 30 h 以内，确定 20 h 为临界值，延长时长不会提升产能，反而增加能耗。该套表达参数下，每升菌液收获 7.5 g 湿菌体，SDS-PAGE 鉴定蛋白全部存在于上清液，无明显包涵体。
其次标定酶切与两级层析纯化参数，这是重组蛋白的表达和纯化的核心环节。酶切单元：温度固定 4℃，反应时长 24 h，梯度设置酶切比例 1:50 至 1:1000，实测 1:50 与 1:100 比例下，融合蛋白切割效率超 95%，结合成本考量，将 1:100 定为标准酶切比例。阴离子交换层析：缓冲液 A 为 50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），缓冲液 A+1 mol/L NaCl 为缓冲液 B；柱平衡使用 3~5 个柱体积缓冲液，上样流速按设备标准设定，流穿组分即为目标融合蛋白，粗纯后纯度＞80%。镍亲和层析：缓冲体系添加 300 mmol/L NaCl，梯度调试咪唑洗脱浓度，确定 80% 缓冲液 B（含 500 mmol/L 咪唑）为最优洗脱条件，上样前样品经 0.45 μm 滤膜过滤，防止层析柱堵塞。整套层析参数运行稳定，设备负荷处于合理区间。
最后完成质量检测参数固化与数据汇总。光谱检测、电泳检测参数固定后，成品纯度稳定达到 95%；BAEE 活性检测体系参数标定完成，实测酶比活力 10.86 U/mg，活性指标合格。整套重组蛋白的表达和纯化工艺参数全部定型后，连续开展 5 批次重复调试，批次间数据偏差小于 2%，工艺稳定性满足中试要求。
综合调试结果，基于双 SUMO 标签的重组蛋白的表达和纯化工艺，参数清晰、设备适配性强，无需复杂的变性复性设备，可直接落地至实验室中试与小型生产线。本次标定的温度、流速、试剂浓度、时长等参数，可直接迁移至其他疏水性蛋白酶的工艺开发。后续可联动自动化控制系统，实现温度、流速、洗脱梯度的实时调控，进一步提升工艺自动化水平与生产效率。
参考文献[1] 陈梓杰，宋晓彤，孟奂，等。重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的可溶表达、纯化及表征 [J]. 华西药学杂志，2026,41 (2):153-157. [2] 阿亚斯，达维希奥。大肠杆菌中牛肠激酶轻链胞内表达与周质表达的对比研究 [J]. 蛋白质杂志，2022,41 (2):157-165.
