作者，Evil Genius
大家看过一个电影么？叫透明人，电影里为了研发一种让人可以隐形的隐形血清，开头有这么一个片段。
那么从现在的角度来看，其实就是运用的蛋白设计和分子动力学模拟，时至今日，我们当然更多的采用Ai蛋白质设计。
接下来为我们的生化小课，CADD计算机辅助药物设计，分子对接/分子动力学做好准备，今日我们分享visium HD的文献，大家有条件，基因组 + 单细胞空间 + 分子对接/分子动力学都学习一下，多组学角度看问题，会比单一组学好很多。
知识积累
研究对象与方法：利用空间转录组学分析26例HPV阳性和阴性HNSCC，系统解析肿瘤结构及肿瘤微环境的空间异质性。
HPV状态差异：HPV阳性HNSCC表现出更高的细胞密度、更多淋巴细胞浸润和更明显的缺氧特征，同时恶性细胞的部分EMT（p-EMT）程度降低。
发现两种p-EMT空间模式：
p-EMT边缘型：位于肿瘤浸润前沿，主要由成纤维细胞通过TGFβ信号诱导p-EMT。
p-EMT核心型：位于肿瘤巢核心，由免疫抑制性巨噬细胞和中性粒细胞通过Oncostatin M（OSM）信号诱导p-EMT。
重要发现：两种p-EMT模式虽然最终产生相似的p-EMT恶性细胞表型，但其诱导细胞、信号通路和空间位置完全不同，且同一肿瘤不同区域具有较稳定的一致性，说明其可能是肿瘤固有的空间组织特征。
核心结论：HNSCC中存在“不同微环境 → 不同细胞间通讯 → 相同p-EMT表型”的空间收敛现象，这种空间异质性可能影响肿瘤侵袭、免疫逃逸，并提示未来治疗可能需要针对不同p-EMT空间生态位采取不同的靶向策略。
在部分口腔癌中，p-EMT细胞主要富集于肿瘤浸润前沿（leading edge），并与更强的侵袭性相关。另一种恶性细胞状态为上皮衰老（epithelial senescence，Epi-sen），其上皮标志物表达升高，并与EGFR抑制剂治疗反应相关。
主要发现：
识别出反复出现的空间基因表达程序，这些程序与此前scRNA-seq鉴定的恶性细胞状态相对应。
发现一种新的空间炎症反应（inflammatory response，Inf-Resp）生态位，主要由靠近恶性细胞的中性粒细胞和巨噬细胞组成。
Inf-Resp相关基因的高表达与独立患者队列中的较差生存预后相关。
HPV阳性肿瘤具有更高的细胞密度和更明显的免疫细胞富集，同时表现出不同的缺氧相关基因表达，并且恶性细胞中的p-EMT减少。
HPV阴性肿瘤存在两种不同的p-EMT空间生态系统：
肿瘤边缘型p-EMT：位于肿瘤浸润前沿，p-EMT细胞与成纤维细胞相邻，并通过TGFβ信号发生联系。
肿瘤核心型p-EMT：位于肿瘤核心区域，由产生Oncostatin M（OSM，抑瘤素M）的髓系细胞诱导，主要涉及巨噬细胞和中性粒细胞。
结果1、利用空间转录组学（ST）解析HNSCC
18例HPV阴性和8例HPV阳性肿瘤。
1. 利用CNV区分恶性细胞和非恶性细胞
由于一个Visium spot直径约 55 μm，通常包含多个细胞，因此首先需要判断每个spot主要由什么类型的细胞组成。
研究者通过分析每个spot中的拷贝数变异（copy-number aberrations，CNAs）来区分恶性细胞和非恶性细胞：
58%的spots具有明显的CNA信号
→ 推测这些spot主要由恶性肿瘤细胞组成。
17%的spots几乎没有CNA信号
→ 推测主要由免疫细胞和基质细胞组成。
25%的spots具有中等CNA信号
→ 被定义为mixed spots（混合spot），提示其中恶性细胞和非恶性细胞比例相近。
此外，在部分样本中，CNA模式还能够进一步区分不同的遗传亚克隆（genetic subclones），并确定这些亚克隆在肿瘤中的空间分布。
2. 一个spot实际上代表一个“微邻域”
研究者特别强调，Visium的一个spot并不是单个细胞。
H&E染色分析显示：
一个spot平均包含约 15个细胞，范围约为 1–47个细胞。
因此，一个Visium spot实际上相当于一个小型的“细胞微邻域（micro-neighborhood）”，其表达谱是多个细胞转录本的混合结果。
尽管如此，研究者认为不同spot之间的主要表达差异，仍然能够反映某些优势细胞类型和细胞状态的空间变化。
3. Leiden聚类 + NMF识别空间表达程序
为了识别这些主要的空间表达模式，研究者采用了两种互补的方法：
Leiden clustering
→ 更适合寻找离散的细胞/表达状态
→ 例如不同类型的细胞群或明确的空间区域。
NMF（Non-negative Matrix Factorization，非负矩阵分解）
→ 更适合寻找连续变化的表达程序。
这是因为Visium数据中，一个细胞类型或细胞状态在不同spot中的比例通常是连续变化的，而不是简单的“有/无”。
最终，在不同样本中共鉴定出 837个expression programs（表达程序），每个表达程序都代表某个样本中特定的基因表达变化模式。
结果2、空间“元程序”（Spatial metaprograms）揭示HNSCC的细胞类型和细胞状态
为了寻找能够在不同患者中反复出现、具有稳定性的基因表达模式，并进一步解析HNSCC肿瘤生态系统中的主要组成成分，研究者首先根据不同表达程序之间的重叠基因数量进行聚类。对于来自多个患者、具有相似表达特征的程序，研究者进一步整合形成共识性的元程序（metaprograms，MPs）。
最终共鉴定出 16种不同的MPs，并通过功能基因集富集分析以及与此前scRNA-seq鉴定的表达程序进行比较，对这些MPs进行注释。
值得注意的是，几乎所有MPs都与一个或两个相关的单细胞表达程序高度相似。这说明，即使Visium spot的分辨率有限、一个spot包含多个细胞，仍然可以通过这种方法较好地识别单个细胞类型或细胞状态对应的基因表达程序。
1. 8种MPs对应非恶性细胞
其中 8种MPs与非恶性细胞类型相关，包括：
免疫细胞：T细胞、B细胞、巨噬细胞
基质细胞：成纤维细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞
非恶性上皮细胞
这些非恶性MPs主要出现在CNA信号较弱或缺失的spots中，并且与相应细胞类型的scRNA-seq表达程序高度相似。
进一步在多个HNSCC转录组队列中进行评分发现：
T细胞、B细胞和分泌型正常上皮（secretory-normal）MPs与更好的5年生存率相关。
这与此前的研究结果一致。
2. 7种MPs对应恶性细胞状态
另外 7种MPs与恶性细胞状态相关。
这些MPs主要出现在CNA信号较高的spots中，并且与scRNA-seq鉴定出的恶性细胞表达程序高度一致。
其中：
Epithelial（上皮型） Senescence（衰老型） Secretory-malignant（恶性分泌型）与更高的5年总生存率（OS）显著相关。
而：
p-EMT
与更低的5年OS显著相关。
因此进一步支持此前的结论：
p-EMT是一种具有较强侵袭性、与较差临床预后相关的恶性细胞状态。
3. 用两种方法解决Visium spot的“多细胞混合”问题
由于一个Visium spot通常包含多个细胞，因此研究者采用两种方法对spot进行细胞状态注释。
方法一：Dominant-MP approach
将每个spot归类为得分最高的MP。
也就是说：
一个spot中哪个细胞类型/状态对应的MP得分最高，就认为它是该spot的主要（dominant）细胞状态。
方法二：Composite-MP approach
进一步对每个spot进行去卷积（deconvolution），推断一个spot中不同MP的组成比例。
因此：
Dominant-MP：回答“这个spot主要是什么？”
Composite-MP：回答“这个spot里面由哪些细胞/状态组成，各占多少？”
后者能够更加精细地描述Visium的多细胞混合特征。
4. 不同解剖部位存在MP富集差异
利用Dominant-MP方法比较不同头颈部解剖亚区后发现，整体上不同部位的MP组成比较相似，但仍存在一些明显差异：
B细胞MP → 富集于口咽部肿瘤 T细胞MP → 富集于口咽部肿瘤 缺氧（hypoxia）MP → 富集于口咽部肿瘤 骨骼肌MP → 富集于口腔肿瘤这些差异具有统计学意义（ANOVA，P < 0.05）。
二、特殊发现：Inf-Resp空间炎症反应MP
前面15种MP基本都能够明确对应某一种恶性或非恶性细胞的scRNA-seq表达程序。
但有一个MP非常特殊：
Inf-Resp（inflammatory response，炎症反应）MP
它并不能简单对应某一种单独的细胞类型。
为什么Inf-Resp特殊？
首先，它是唯一一个与单细胞表达程序相似度较低的MP。
其次，Inf-Resp富集的spots具有中等程度的CNA信号。
这说明这些spots很可能同时存在：
恶性细胞 + 髓系免疫细胞
5. Inf-Resp主要对应巨噬细胞和中性粒细胞
研究者重新分析scRNA-seq数据发现：
Inf-Resp基因表达特征主要对应：
免疫抑制性巨噬细胞 中性粒细胞但CNA分析进一步表明，这些Inf-Resp spots除了髓系细胞之外，还含有明显的恶性肿瘤细胞。
进一步的空间去卷积分析也发现：
Inf-Resp spots中的恶性细胞比例明显高于其他免疫或基质细胞相关spots。
因此，Inf-Resp并不是简单的“炎症细胞区域”，而更可能代表一个：
恶性细胞 + 免疫抑制性髓系细胞高度共定位的空间微环境。
6. Inf-Resp与患者预后不良相关
Inf-Resp MP与较低的总体生存率（OS）显著相关。
因此认为：
Inf-Resp可能代表HNSCC中的一种具有临床意义的免疫抑制性炎症空间生态位。
其核心特征可以理解为：
中性粒细胞/免疫抑制性巨噬细胞 ↓ 与 ↓ 恶性肿瘤细胞空间共定位 ↓ 形成 Inf-Resp空间生态位 ↓ 可能促进肿瘤恶性进展 ↓ 患者预后较差发现Inf-Resp是一个特殊的“细胞互作生态位”:免疫抑制性巨噬细胞 + 中性粒细胞 ↔ 恶性细胞.
结果3、HPV状态影响HNSCC肿瘤生态系统的整体空间组织
为了描述HNSCC肿瘤内部的整体空间组织方式，研究者定义了两个定量空间指标：
空间一致性（spatial coherence）
用于衡量某一种MP对应的spots是倾向于聚集在一起，还是分散分布于整个肿瘤中。
两两耦合评分（pairwise coupling score）
用于衡量两个不同MP是否倾向于在空间上共同出现/共定位。
1. HNSCC存在明显的“恶性—基质—免疫”三大空间区室
两两耦合分析发现：
不同恶性细胞状态之间存在较多正向空间互作；
不同非恶性细胞类型之间也存在较多正向互作；
但恶性MP与非恶性MP之间总体以负向互作为主。
进一步构建无监督空间网络，将MP作为节点，将显著空间互作作为边，发现HNSCC整体上形成三个主要空间区室：
恶性区室（malignant）—基质区室（stromal）—免疫区室（immune）
三个区室之间并不是广泛连接，而主要通过少数特异性互作联系。
其中最重要的连接包括：
p-EMT ↔ 成纤维细胞 → 位于恶性—基质界面 补体激活型成纤维细胞 ↔ 免疫细胞 → 位于基质—免疫界面这说明HNSCC并不是随机混合的细胞群，而具有明显的空间生态系统分区。
2. 不同细胞状态的空间聚集程度不同
空间一致性分析显示：
骨骼肌MP → 空间一致性最高，最容易形成聚集区域 Senescence（衰老）MP → 一致性也较高 p-EMT → 一致性较低 Endothelial（内皮）MP → 一致性最低说明不同细胞类型/状态在肿瘤中的空间组织方式存在明显差异。
此外，Inf-Resp和补体-成纤维细胞（complement–fibroblast）的跨肿瘤差异最大，提示这两类空间生态位在不同患者中可能存在两种主要模式：
聚集型（clustered） vs 分散型（dispersed）二、HPV状态显著影响HNSCC空间生态系统
考虑到HPV阳性和HPV阴性HNSCC在临床和病理学上存在明显差异，研究者进一步比较了两者的空间组织。
HPV阳性HNSCC具有更强的免疫生态系统
HPV阳性肿瘤表现出：
淋巴细胞比例更高 免疫细胞之间的空间互作更强 淋巴细胞空间一致性更高这些特点与HPV阳性HNSCC中报道的三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLS）相一致。
也就是说：
HPV阳性HNSCC具有更加成熟、组织化的免疫空间生态。
3. HPV阳性肿瘤：缺氧↑，p-EMT↓
在恶性细胞区室中，HPV阳性肿瘤表现出：
Hypoxia ↑ p-EMT ↓也就是说，HPV阳性HNSCC虽然具有更强的免疫浸润，但其恶性细胞的p-EMT状态相对减少，同时缺氧相关程序更加明显。
为了排除解剖部位造成的影响，研究者进一步只分析口咽部肿瘤。
结果仍然发现：
Hypoxia显著增加：P = 3.39 × 10⁻⁴ T细胞比例呈增加趋势：P = 0.205 p-EMT呈降低趋势：P = 0.0816不过由于HPV阴性口咽癌只有2例，因此后两项统计能力有限。
三、HPV表达本身也存在肿瘤内异质性
此前研究已经发现，同一个HPV相关HNSCC内部，不同恶性细胞可能存在：
HPV-on：HPV基因表达较高 HPV-off：HPV基因表达较低/缺失因此研究者进一步分析HPV转录本在不同肿瘤以及不同遗传亚克隆中的分布。
结果发现：
肿瘤间存在明显差异
不同HPV阳性肿瘤之间：
HPV转录本的检测比例差异很大，而且这种差异超过了单纯技术因素能够解释的范围。
肿瘤内不同亚克隆也存在差异
在具有多个CNA定义遗传亚克隆的HPV阳性肿瘤中：
某些亚克隆 → HPV阳性spots相对富集 另一些亚克隆 → HPV阳性spots相对减少但这种亚克隆之间的差异总体比较温和。
因此，HPV阳性肿瘤并不是简单的“所有肿瘤细胞都具有相同程度的HPV表达”，而是存在不同程度的HPV基因表达状态。
四、最有意思的发现：HPV阳性肿瘤细胞密度显著更高
除了细胞组成和空间互作之外，研究者还发现HPV阳性和阴性HNSCC存在非常明显的细胞密度差异。
平均每个Visium spot中的细胞数量：
肿瘤类型 每spot中位细胞数 HPV阴性 10个 HPV阳性 26个也就是说：
HPV阳性肿瘤每个spot的细胞数量约为HPV阴性的2.6倍。
而且这种高细胞密度并不是局限于某一种细胞：
恶性细胞spots ↑ 基质细胞spots ↑ 免疫细胞spots ↑因此分析认为：
HPV阳性的高细胞密度是整个肿瘤范围内的整体性现象，而不是某一种细胞局部增多造成的。
核心结论：HNSCC具有高度组织化的空间生态系统，可划分为恶性、基质和免疫三个主要区室；而HPV状态显著重塑这一空间架构。HPV阳性HNSCC表现出更高的整体细胞密度、更强的淋巴细胞组织化和免疫互作，同时恶性细胞呈现“缺氧增强、p-EMT减少”的特征。
而且这部分为后面非常关键的发现做了铺垫：虽然HPV阳性和阴性肿瘤整体空间架构不同，但在HPV阴性HNSCC中，p-EMT本身还可以通过不同的空间微环境被诱导——即肿瘤边缘的TGFβ-成纤维细胞模式，以及肿瘤核心的OSM-髓系细胞模式。
结果4、 分区分析揭示两种不同的p-EMT空间模式
研究者接下来重点分析恶性肿瘤细胞区室内部的空间结构。根据恶性spot与非恶性细胞区室之间的距离，将恶性spot划分为三个区域：
- 肿瘤边缘（tumor edge）：与非恶性细胞spot直接相邻的恶性spot；
- 肿瘤核心（tumor core）：位于肿瘤巢核心、距离非恶性区域较远的恶性spot；
- 肿瘤中部（mid-tumor）：介于边缘和核心之间的恶性spot。
随后研究者分析不同MP在这三个区域中的分布。
1. 不同恶性细胞状态具有不同的空间分布
非恶性MP基本呈现一致的空间规律：
非恶性区域最高 → 肿瘤边缘逐渐下降 → 肿瘤核心最低。
而恶性MP的空间分布更加多样：
- 细胞周期（cell cycle）：倾向于在肿瘤边缘达到最高；
- 缺氧（hypoxia）：在肿瘤核心富集；
- 恶性分泌型（secretory-malignant）：核心富集；
- 衰老（senescence）：核心富集；
- 其他MP则表现出较弱或非单调的空间变化。
值得注意的是，Inf-Resp虽然主要由髓系细胞信号构成，但它的空间分布却类似于恶性MP，即：
非恶性区域最低，而在恶性区域升高。
这进一步支持Inf-Resp实际上代表髓系细胞与恶性细胞共同构成的空间生态位。
二、发现两种截然不同的p-EMT空间模式
此前研究认为，p-EMT主要存在于肿瘤浸润前沿（leading edge），并且可能与邻近成纤维细胞相互作用有关。
但是，当研究者对单个肿瘤进行zonation分析后，发现了两种完全不同的p-EMT空间模式：
① p-EMT edge型
p-EMT主要集中在：
肿瘤边缘
在12个肿瘤中观察到这种模式。
② p-EMT core型
p-EMT主要集中在：
肿瘤核心
共有6个肿瘤表现出这种模式。
因此：
p-EMT并不一定只存在于肿瘤边缘。
它可以出现在：
Edge → p-EMT
或者：
Core → p-EMT
三、Visium HD进一步验证了两种模式
由于传统Visium的空间分辨率有限，研究者进一步利用具有更高空间分辨率的Visium HD进行验证。
结果证实：
p-EMT core肿瘤
p-EMT表达：
贯穿整个恶性肿瘤巢
p-EMT edge肿瘤
p-EMT表达：
主要局限于肿瘤边缘
因此，两种p-EMT模式并不是传统Visium低分辨率造成的假象，而是真实存在的空间组织模式。
四、两种p-EMT模式是肿瘤特异性的
接下来一个非常重要的问题是：
同一个肿瘤不同区域，会不会同时存在edge型和core型？
研究者进一步分析了一个包含100例口腔癌患者的队列。
每位患者从肿瘤不同区域取出2–4个直径2 mm的组织核心，制作组织芯片（TMA），并通过p-EMT标志物LAMC2检测p-EMT分布。
将每个组织核心分为：
- diffuse/core
- edge
- low
- mixed
结果发现：
同一个患者不同肿瘤区域的p-EMT模式具有高度一致性。
具体而言：
- 74%的患者至少有3/4个组织核心表现出相同的LAMC2模式；
- 如果这种一致性完全由随机因素造成，预计只有约28%；
- P = 0.0001。
因此说明：
p-EMT空间模式更可能是整个肿瘤固有的、肿瘤特异性的生物学特征，而不是简单的取样位置造成的结果。
换句话说，一个肿瘤倾向于形成edge型p-EMT还是core型p-EMT，可能是该肿瘤整体生态系统的稳定特征。
五、p-EMT模式并不是由肿瘤组织学生长模式决定的
研究者进一步探讨：
p-EMT edge/core是否只是不同肿瘤组织学结构造成的？
根据恶性spot之间的空间一致性，将肿瘤分成三类：
肿瘤-基质分区型（compartmentalized）
- 肿瘤和基质相对分离
肿瘤-基质混合型（intermixed）
- 肿瘤和基质高度混杂
中间型（intermediate）
结果发现：
p-EMT edge和p-EMT core两种模式都可以出现在这三种组织结构中。
不同组织学生长模式之间p-EMT edge/core的比例没有显著差异。
虽然存在一些趋势：
- 分区型 → 倾向于p-EMT edge
- 混合型 → 倾向于p-EMT core
但均没有达到统计学显著性。
因此作者认为：
p-EMT edge/core并不是简单由肿瘤的组织学生长模式决定的。
六、这一部分的核心发现
这一部分是整篇文章非常关键的发现之一，可以浓缩成：
传统认识
肿瘤边缘 → 成纤维细胞 → p-EMT
↓
本研究发现
实际上存在两种空间模式：
模式1：p-EMT edge
肿瘤边缘
→ p-EMT ↑
→ 传统的leading-edge模式
模式2：p-EMT core
肿瘤核心
→ p-EMT ↑
→ 全新的核心型p-EMT模式
最重要的结论
p-EMT具有明显的空间异质性，可以形成“边缘型”和“核心型”两种稳定的空间生态模式，而且这种模式具有肿瘤特异性，并不主要由组织学生长结构或局部取样位置决定。
这为下一步非常关键的机制研究提供了问题：
为什么有些肿瘤在边缘产生p-EMT，而另一些肿瘤却在核心产生p-EMT？
后文的答案就是：
p-EMT edge → 成纤维细胞/TGFβ驱动
p-EMT core → 巨噬细胞/中性粒细胞/OSM驱动
也就是说，不同空间位置的p-EMT背后实际上对应不同的TME细胞通讯机制。
结果5、 p-EMT edge和p-EMT core代表两种不同的肿瘤生态系统
为了研究不同p-EMT空间模式背后的差异，同时避免HPV状态这一混杂因素的影响，研究者后续分析仅纳入HPV阴性HNSCC。
研究者比较了p-EMT edge和p-EMT core两组肿瘤的多个特征，包括：
- 各MP的丰度
- MP的空间一致性（spatial coherence）
- 不同MP之间的空间耦合（pairwise coupling）
结果发现，两组肿瘤在上述多个指标上均存在广泛差异，说明：
p-EMT edge和p-EMT core并不是简单的空间位置差异，而是对应两种不同的肿瘤生态系统。
1. 两种p-EMT肿瘤的细胞组成不同
与p-EMT edge肿瘤相比，p-EMT core肿瘤表现出：
- B细胞spots减少
- 恶性衰老细胞减少
- 增殖中的恶性细胞增加
- Inf-Resp spots显著增加
尤其值得注意的是：
Inf-Resp在p-EMT core肿瘤中明显富集。
这提示p-EMT core与髓系炎症/免疫抑制生态位密切相关。
2. 两种模式的免疫空间组织也不同
空间一致性分析发现：
- p-EMT core肿瘤中的T细胞空间一致性更低
- 即T细胞更加分散
- 免疫区室整体相对受到排斥
而空间耦合分析显示：
p-EMT core肿瘤中，恶性细胞与基质细胞之间的连接增强，但免疫区室相对被排除。
因此，p-EMT core肿瘤表现出一种：
恶性细胞 + 基质/髓系细胞增强
同时：
淋巴细胞减少/排斥
的空间生态。
二、最关键的发现：p-EMT的“邻居”不同
这是这一部分最核心的结果。
p-EMT edge
在p-EMT edge肿瘤中：
p-EMT ↔ 成纤维细胞（fibroblast）
p-EMT主要位于肿瘤边缘，并与成纤维细胞空间共定位。
p-EMT core
而在p-EMT core肿瘤中：
p-EMT ↔ Inf-Resp
也就是p-EMT与由髓系细胞和恶性细胞共同构成的Inf-Resp生态位发生空间共定位。
因此：
p-EMT edge → fibroblast-associated
p-EMT core → Inf-Resp/myeloid-associated
三、进一步证明不是“100 μm尺度”的假象
研究者进一步分析更精细的spot内共定位，而不是只观察约100 μm尺度的邻域。
他们首先找出p-EMT占优势的spots，然后根据是否同时表达：
- Fibroblast MP
- Inf-Resp MP
- 两者
进行分组。
结果非常明确：
p-EMT edge
p-EMT + Fibroblast
显著富集。
p-EMT core
p-EMT + Inf-Resp
显著富集。
而且在基因表达层面也观察到了同样的共现模式。
这说明两种p-EMT模式的差异不是简单的远距离空间相关，而是真正存在局部细胞共定位/细胞间相互作用。
四、CODEX多重免疫荧光进一步验证
为了在蛋白水平验证空间转录组结果，研究者利用CODEX多重免疫荧光分析了一个独立的40例喉部HNSCC组织芯片（TMA），使用31种蛋白标志物。
最终可靠识别出：
- 3个p-EMT core肿瘤
- 6个p-EMT edge肿瘤
结果与Visium完全一致。
p-EMT core
p-EMT细胞：
弥漫分布于整个恶性肿瘤巢内部
p-EMT edge
p-EMT细胞：
主要限制在肿瘤与TME交界面
进一步计算p-EMT细胞到肿瘤-TME界面的距离发现：
p-EMT core肿瘤中的p-EMT细胞平均距离显著更远。
这从蛋白水平证明了两种空间模式确实存在。
五、p-EMT core中髓系细胞大量增加
CODEX进一步发现：
p-EMT core肿瘤中，肿瘤内部髓系细胞密度超过p-EMT edge肿瘤的10倍。
而且两类肿瘤中p-EMT细胞的“最近邻”也不同：
p-EMT core
p-EMT细胞 → 更接近髓系细胞
而不是成纤维细胞。
p-EMT edge
p-EMT细胞 → 更接近成纤维细胞
而不是髓系细胞。
因此从空间转录组 → spot共定位 → 基因表达 → CODEX蛋白成像 → 细胞距离多个层面，都得到一致结论。
六、最终模型
这篇文章最终提出了两个完全不同的p-EMT生态位：
① p-EMT edge niche
肿瘤边缘
↓
成纤维细胞
↓
p-EMT细胞
特点：
- p-EMT局限于肿瘤-TME交界处
- 与成纤维细胞高度共定位
- 主要发生在肿瘤浸润前沿
② p-EMT core niche
肿瘤核心
↓
髓系细胞 / Inf-Resp
↓
p-EMT细胞
特点：
- p-EMT弥漫分布于整个肿瘤巢
- 髓系细胞大量增加
- Inf-Resp显著富集
- 淋巴细胞相对排斥
- 恶性细胞增殖增强
七、核心总结
可以把这一部分浓缩成一句话：
HPV阴性HNSCC中存在两种截然不同的p-EMT生态系统：p-EMT edge是“成纤维细胞-肿瘤边缘型”，p-EMT core则是“髓系细胞-肿瘤核心型”；前者主要表现为肿瘤边缘p-EMT与成纤维细胞共定位，后者则表现为肿瘤核心弥漫性p-EMT、髓系细胞大量浸润以及淋巴细胞排斥。
而且作者通过Visium → Visium HD → TMA → CODEX → 细胞距离分析逐层验证，使这个结论非常有说服力。
最值得记住的逻辑：
相同的p-EMT表型 ≠ 相同的微环境机制。
p-EMT edge：Fibroblast → p-EMT
p-EMT core：Myeloid/Inf-Resp → p-EMT
这也是下一部分研究TGFβ和OSM两条不同p-EMT诱导通路的直接理论基础。
结果6、 p-EMT core由OSM信号介导
为了进一步解释p-EMT edge和p-EMT core两种模式之间的差异，研究者比较了两类p-EMT优势spots：
- p-EMT core：位于肿瘤核心，同时表达Inf-Resp；
- p-EMT edge：位于肿瘤边缘，同时表达fibroblast MP。
重点分析了两组spots中差异表达的配体（ligand）和受体（receptor），希望寻找可能介导细胞间通讯的信号。
1. 发现OSM–OSMR信号轴
大多数差异表达基因实际上主要由Inf-Resp或成纤维细胞表达，因此这些差异可能反映的是：
p-EMT细胞附近髓系细胞或成纤维细胞的影响。
但有一部分配体和受体在Inf-Resp和fibroblast spots中的表达相近，更可能代表两类p-EMT细胞本身的差异。
其中最值得关注的是：
- OSMR（Oncostatin M receptor）→ p-EMT core中更高
- OSM（Oncostatin M）→ 主要由Inf-Resp中的髓系细胞表达
进一步scRNA-seq验证发现：
OSMR主要表达于p-EMT细胞，而OSM主要表达于巨噬细胞和中性粒细胞。
因此形成了一个非常明确的细胞间通讯关系：
巨噬细胞/中性粒细胞
↓ 分泌
OSM
↓
p-EMT细胞上的OSMR
↓
p-EMT程序
2. OSM是Inf-Resp髓系细胞中特别重要的信号
Inf-Resp中还发现其他可能诱导EMT的配体，例如：
- IL1B
- SPP1
这些基因也主要由巨噬细胞和中性粒细胞表达。
但是，它们对应的受体并没有在p-EMT core中表现出特异性增强。
因此相比IL-1β和SPP1：
OSM–OSMR更符合p-EMT core中的特异性细胞间通讯机制。
二、空间证据支持OSM–OSMR信号
研究者进一步从空间层面验证OSM是否真正与p-EMT core相关。
① p-EMT core中p-EMT更容易邻近Inf-Resp
p-EMT core肿瘤中：
p-EMT spots出现Inf-Resp邻居的概率显著高于p-EMT edge肿瘤。
这符合旁分泌（paracrine）信号传递的空间要求。
② Inf-Resp在p-EMT core中更加聚集
Inf-Resp的空间一致性在p-EMT core肿瘤中更高。
意味着：
Inf-Resp髓系细胞更容易形成聚集区域，可能形成一个OSM分泌中心（signaling hub）。
③ OSM主要集中在Inf-Resp中
虽然整体来看OSM阳性spots比例只有约5.5%，但OSM明显富集于Inf-Resp spots。
尤其是在：
被其他Inf-Resp spots包围的Inf-Resp spots中，OSM阳性率达到27.2%。
说明髓系细胞聚集越明显，OSM表达越突出。
而这些：
OSM⁺ Inf-Resp区域
与
p-EMT区域
在p-EMT core肿瘤中高度共定位。
④ p-EMT细胞对OSM的敏感性更高
研究者进一步发现：
p-EMT core中，一个p-EMT spot表达OSMR的概率显著高于p-EMT edge。
即使控制了每个spot中p-EMT细胞比例之后，这种差异仍然存在。
说明：
p-EMT core中的p-EMT细胞不仅更靠近OSM来源，而且自身具有更高的OSMR表达，因此对OSM信号更加敏感。
三、体外实验验证：OSM能够诱导EMT
为了进一步验证OSM是否能够直接诱导p-EMT，研究者使用重组OSM处理两种HNSCC细胞系，并进行RNA-seq。
结果发现：
OSM处理后
- EMT相关基因明显激活
- 多个免疫相关基因上调
- OSMR本身也进一步升高
这提示存在一个潜在的：
OSM → OSMR ↑ → 对OSM更加敏感
的正反馈环路。
相比之下：
- SPP1
- IL-1β
处理并没有明显诱导EMT相关基因。
因此进一步支持：
OSM而不是SPP1或IL-1β，是p-EMT core中重要的EMT诱导信号。
四、OSM和TGFβ都可以诱导p-EMT
此前研究已经证明：
TGFβ可以诱导HNSCC的p-EMT。
因此作者进一步比较了：
OSM vs TGFβ
对HNSCC细胞的作用。
结果发现两种信号都能够激活一部分共同的p-EMT相关基因，例如：
- PDPN
- LAMC2
- ITGA5
- 多种laminin
- 多种collagen
大约：
40%的EMT相关基因可以被OSM和TGFβ共同激活。
剩余约60%的基因则表现出一定差异，其中更多是TGFβ特异性激活的。
总体而言：
TGFβ在体外诱导p-EMT的能力强于OSM。
五、最重要的机制模型
这部分最终建立了一个非常漂亮的“两种上游信号 → 一个共同p-EMT终点”模型：
p-EMT edge
成纤维细胞
↓
TGFβ
↓
p-EMT细胞
↓
p-EMT程序
p-EMT core
巨噬细胞 + 中性粒细胞
↓
OSM
↓
OSMR⁺ p-EMT细胞
↓
p-EMT程序
六、为什么OSM和TGFβ不同，最后却产生类似的p-EMT？
这是文章最有意思的机制结论之一。
虽然：
OSM和TGFβ的上游来源不同
↓
激活的基因也并不完全相同
↓
但最终：
p-EMT core MP ≈ p-EMT edge MP
两种空间MP在整体上高度相似、几乎难以区分。
说明：
OSM和TGFβ可能通过不同的上游细胞通讯机制，最终汇聚到一个共同的p-EMT下游转录程序。
因此可以概括为：
不同TME细胞
→不同配体
→不同信号通路
→共同p-EMT转录状态
一句话总结
p-EMT edge主要由成纤维细胞来源的TGFβ驱动，而p-EMT core则由巨噬细胞和中性粒细胞来源的OSM通过OSMR驱动；两种机制虽然上游不同，但最终汇聚到高度相似的p-EMT转录程序，形成“HNSCC中不同空间微环境诱导相同恶性细胞状态”的机制模型。
