Improving freshwater ecosystem assessment via the integration of eDNA-based multitrophic biotic groups
通过整合基于eDNA的多营养生物群来改善淡水生态系统评估
研究背景：
作者认为，只看水质或者只看一个生物类群，可能无法全面评价淡水生态系统健康，因此利用eDNA同时检测多个营养类群，并把这些生物群落的信息整合起来评价湖泊生态健康。
主要内容：
1.开发了一种基于eDNA的多营养生物完整性指数（IBIm）来评估水生生态健康
2.与仅依赖单一分类群或水质的指标相比，IBIm在检测生态退化方面表现出更高的敏感性。
样本采集：
在中国江淮流域40个湖泊的98个采样点同时采集了水和沉积物样品。得到了98个水样品和80个沉积物样品。每个样点取3L。用0.22μm滤膜过滤直至过滤器堵塞。
水质物理化学指标测定：
pH值、浊度（TUR）、溶解氧（DO）、水温（WT）和水的透明度（SD）（Secchi盘测定）
实验室指标测定：
总氮（TN）、总磷（TP）、铵态氮（NH4+）、亚硝酸盐氮（NO2-）、主要离子（Ca2+、Mg2+、Cl-、SO42-）和叶绿素a（Chl-a）
营养状态指数（TSI）：使用TN、TP、Chl-a和SD计算，以表征每个地点的营养状况
使用针对不同遗传标记的四组引物来表征细菌、真菌、真核藻类和无脊椎动物：
使用引物 515F/806R 扩增细菌16S rRNA基因的 V4 区；
使用引物 gITS7F/ITS4R 扩增真菌 ITS2 区；
使用引物 1380F/1510R 扩增真核 18S rRNA 基因的 V9 区，以靶向真核藻类（蓝藻除外）；
使用引物 mlCOIntF/gHCO2198 扩增线粒体细胞色素氧化酶亚基I（COI）基因的313 bp片段，以靶向无脊椎动物。
数据库：
SILVA v138.1 搜索细菌
UNITE 2024.04.04搜索真菌
SILVA 和 PR2 搜索真核藻类
BOLD 和 MIDORI2 搜索无脊椎动物
① 细菌
代表：
分解者
② 真菌
同样与：
分解、物质循环
有关。
③ 真核藻类
代表：
初级生产者
④ 无脊椎动物
代表：
消费者
所以作者想建立的是：
分解者 + 生产者 + 消费者
这样才能覆盖淡水生态系统不同的营养层次。
（分类群和WQI水质等级之间的对应关系。文章明确将 WQI ≥ 85 定义为 Excellent，70–85 为 Good，50–70 为 Moderate）
多营养综合生物完整性指标（IBIm）工作流程：
Hub taxa：关键类群，也就是在群落网络中具有重要连接作用的关键分类群。
第二步：指标筛选和标准化
Correlation analysis相关性分析
Multicollinearity test多重共线性检验
Sensitive metrics敏感指标(I)：对生态环境变化比较敏感的指标。哪些生物指标能够更好地区分不同生态健康状态？
Sensitivity Index：敏感性指数SI，也就是把不同的原始敏感指标I转换成一个可以比较的尺度。
：第i个生物类群对应的生物完整性指数。
第三步：分别建立不同生物类群的IBI
图中展示不同生物类群的 IBI（Biological Integrity Index，生物完整性指数）得分在所有采样样本中的分布情况。
真菌IBI大多数样本集中在评分40-60左右，生物完整性较低；无脊椎动物大多数样本的IBI评分在80-95左右，评分比较高。
第四步：多营养级生物完整性指数
公式的意思是：把不同生物类群的IBI按照一定权重进行整合；代表第i个生物类群的IBI。
Ri代表这个生物类群的权重。
所以最终：
这就是多营养级综合生物完整性指数。
核心：
作者先利用理化指标建立水质评价（WQI），同时利用eDNA获得细菌、真菌、藻类和无脊椎动物的α多样性、群落组成及关键分类群等生物信息；随后筛选对生态环境变化敏感的生物指标并进行标准化，分别构建各生物类群的IBI，最后按照各类群权重将多个IBI整合为多营养级生物完整性指数IBIₘ，从而实现对淡水生态系统健康状况的综合评价。
IBIm与WQI之间的相关分析（线性回归分析）
1.所有单一分类群IBI和IBIm与WQI呈正相关，与TSI呈负相关。
TSI：营养状态指数（Trophic State Index）
TSI越高，水体营养状态越高/富营养化程度越明显。
2.随着水体营养状态升高、富营养化程度增强，IBIₘ呈下降趋势
不同营养类群的IBIm一致性？IBI与水体环境质量指标之间的关系？
左边：单营养群IBI与综合营养级IBIm的Spearman相关分析
1.综合 IBIₘ 与各单类群 IBI 都呈较强正相关，说明不同生物类群的生态完整性具有一定一致性，多营养级整合具有合理性；而不同单类群之间的相关性相对较弱；
右边：IBI与环境因子的Spearman相关分析
2.所有IBI与WQI呈显著正相关，IBI与TSI营养状态指数（Trophic State Index）呈显著负相关，表明生物完整性能够较好地响应水体整体生态质量和营养状态；
WQI和TSI从两个不同角度共同验证了IBI对水体生态环境变化的响应。
3.所有IBIₘ与TP、TN等营养盐呈显著负相关，说明较高的营养盐水平与较低的生物完整性相伴随，较高的营养盐水平可能与水体生态退化和富营养化过程相关，进一步表明eDNA获得的生物群落信息具有潜在的生态环境指示价值。
多营养IBI与所有这些环境因素显著相关，并且通常表现出比任何单一分类群IBI更强的相关性。
因此，单一生物类群可能只能反映水生态系统某一方面的信息，而多营养级整合能够提供更加综合的生态完整性评价。
生物完整性指数IBIₘ和β多样性（生物群落组成差异）之间的关系，IBIₘ的变化是否能够反映群落组成的变化？（Mantel检验）
（a）水体（b）沉积物 ；r 代表相关程度，统计显著 ≠ 相关性强。
横坐标：IBIₘ changes是两个样品之间IBIₘ的差异程度
例如有两个样品：
- 样品A：IBIₘ = 70
- 样品B：IBIₘ = 75
那么两个样品的IBIₘ差异就是：
∣70−75∣=5
如果：
- 样品C：IBIₘ = 90
那么A和C之间的差异就是：
∣70−90∣=20
因此：
横坐标越大 → 两个样品之间的IBIₘ差异越大。
纵坐标：是Bray-Curtis群落不相似性，它反映两个样品的群落组成有多不一样。
1.在水体和沉积物中，IBIₘ差异总体与细菌、真菌和无脊椎动物群落的Bray-Curtis不相似性呈显著正相关，而与藻类群落不相似性的相关关系不显著。IBIₘ的变化在一定程度上能够反映多营养类群β多样性/群落组成的变化。
生物完整性指数IBIₘ和β多样性贡献程度（LCBD）之间的关系，一个样品的IBIₘ越高，这个样品的群落组成是不是越独特？
LCBD：局部β多样性贡献率，表示某一个样品的群落组成，在多大程度上“贡献”了整个研究区域的β多样性。
1.在水体中，仅真菌群落的LCBD与IBIₘ呈显著正相关，其余类群均未表现出显著关系；
2.沉积物中真菌、真菌藻类与无脊椎动物群落的LCBD与IBIₘ具有较明显的正向关系。
LCBD（Local Contribution to Beta Diversity）：局地对β多样性的贡献
简单理解：
一个湖泊的生物群落是不是“很独特”？
举例，假设有10个湖，其中9个湖的鱼类、藻类、细菌群落都非常相似。但是湖10的生物组成和其他湖完全不一样，那么湖10的LCBD很高。它是一个具有独特生物群落的湖泊。
文章发现一个非常有意思的现象，IBIm越低的湖泊，其LCBD也越低。
生态退化越严重
↓
生物群落越不独特
↓
不同湖泊之间越来越相似
这就是：生物同质化（biotic homogenization）
RDA（冗余分析，Redundancy Analysis）：不同生物类群的群落组成变化，到底与哪些环境因子有关？加入生物完整性指数（IBI）之后，能不能更好地解释群落组成变化？
（a）只使用理化环境因子的RDA；（b）同时加入生物完整性指数和理化因子
箭头代表环境变量，箭头指向哪里，就表示：这个方向上的样品与该环境因子的关系更强。箭头越长，通常说明该变量对排序结果的解释作用越强。
1.单纯使用理化环境变量只能解释部分群落组成变化，而加入生物完整性指标后，对不同生物类群群落结构的解释能力得到不同程度的提高；真菌群落和无脊椎动物群落的解释能力提升比较明显。
基于IBI的湖泊生态健康评价
用传统水质指数 WQI 评价湖泊时，湖泊整体状况看起来比较好；但加入不同生物类群的生物完整性指数（IBI）后，不同生物类群给出的生态健康评价存在明显差异。
1.几乎所有的IBI评分都一直低于WQI，除了无脊椎动物的IBI，这表明生物完整性评估比物理化学评估更保守；
2.sankey图体现了不同评价指标对湖泊生态状态的判断存在明显差异；说明单一水质指标难以全面反映湖泊生态系统的生物完整性，多营养级生物指标能够提供更加综合的生态健康信息。
不同区域的IBI生物完整性指数
基于理化水质指标的评价结果整体上较基于生物完整性的评价更为乐观。
同时，基于IBIₘ的湖泊生态状态主要分为良好和中等两个等级，并呈现一定的空间异质性，说明传统水质指标与生物群落响应所反映的生态状态并不完全一致。
