简介：这是一份面向生物医学图像处理与机器学习初学者的MATLAB实用项目，目标是从培养皿平板琼脂图像中自动识别并统计细菌菌落数量，替代传统人工计数，提升实验效率并降低主观误差。资源包共含5个文件，总大小仅174KB，其中两个MATLAB脚本分别承担核心计数算法与演示流程，两张示例图像包括原始平板照片和掩膜标记叠加结果，便于直观对照，另附txt授权说明文件。已有839人浏览学习，适合微生物科研人员、高校实验课程师生以及图形界面开发初学者参考。解压后可查看授权信息，运行演示脚本即可在自带图像上复现预处理、分割、形态学处理、连通区域分析和分类计数的完整链路；核心代码支持调整阈值、形态学核尺寸，或进一步替换为CNN分类器，为定制自动化菌落计数系统提供了灵活起点。 先说说我做这个项目的契机。实验室里每天要数培养皿上的菌落，人工数到一百多个就眼花，不同人数的结果还不一样，一份数据统计下来，光数数就要耗掉大半天。后来我直接用MATLAB写了一套自动化计数的图像处理脚本，配合Image Processing Toolbox，从读图到输出数量全程跑下来，一个菌落密集的平板大概几秒钟就能出结果，和人工数的误差控制在百分之几以内。这篇文章就把这套方法的完整思路、核心代码逻辑和踩过的坑都整理出来，给同样被“数菌落”折磨的同行一个能直接上手的参考。
整体内容围绕三件事展开：怎么把彩色菌落图像处理成干净的二值图，怎么把粘连在一起的菌落正确分开，以及怎么让计数结果稳定可靠、不挑拍摄环境。无论你是要处理培养皿照片，还是显微镜下的细菌视野，这套思路都能迁移过去。
1. 整体设计思路：为什么选图像分割这条路
1.1 自动化计数的核心难点在哪
菌落计数的本质，是统计图像中有多少个独立的“目标区域”。听起来很简单，但实际操作里会遇到三个问题：背景不是纯色，培养基可能有气泡、划痕；菌落之间有粘连，一个区域里可能叠着好几个菌落；光照不均匀，有的菌落边缘亮、有的中间亮。我最早试过用颜色阈值分离菌落，但因为培养基颜色和菌落颜色太接近，效果一直不稳定。后来换成了“灰度化 + 形态学增强 + 自适应分割 + 距离变换分水岭”这条经典路线，才把问题理顺。
MATLAB在这一块的优势在于：图像处理的函数库非常全，从读取图像到形态学操作、连通域分析、分水岭分割，全部有现成函数。不需要自己逐像素实现算法，可以把精力集中在参数调优和特征筛选上。另外它自带的Image Segmenter App可以先做交互式探索，把阈值、形态学算子这些参数先试出来，再固化到脚本里，调试效率比纯写代码高很多。
1.2 两种典型场景用什么策略
根据“细菌群”的形态，我把场景分成两类：第一类是培养皿/平板上的菌落，特征是目标大、数量相对少、颜色与背景差异明显，但菌落之间容易粘连。这个场景用“全局阈值分割 + 分水岭”就能解决。第二类是显微镜下的细菌涂抹视野，特征是目标小、数量极多、细胞彼此挨得很近，甚至重叠，这个要更抠细节，先做去噪增强，再用距离变换找种子点，才能分得开。
我的项目以第一个场景为主要对象，但代码里保留了面向第二场景的处理模块，实际跑下来同样适用。本文重点讲第一场景的实现，第二场景的参数调整会在常见问题部分补一句。
2. 图像预处理与前景分割：一切从干净的图开始
2.1 灰度化、去噪与光照校正的具体操作
读入图像后第一件事不是直接二值化，而是先做三步预处理。第一步，把彩色图像转成灰度图，用rgb2gray。这一步会丢失颜色信息，所以更适合菌落灰度与背景有差异的情况，如果你的菌落是有颜色的（比如粉色的假单胞菌），可以考虑在HSV空间里做色调筛选，这个后文会提。第二步，用中值滤波或者高斯滤波去噪，代码就是：
img = imread('plate.jpg'); if size(img, 3) == 3 gray = rgb2gray(img); else gray = img; end % 中值滤波去噪，窗口取3或5，太大会模糊边缘 denoised = medfilt2(gray, [5 5]);第三步很关键，就是背景不均匀问题的处理。培养皿边缘或底部往往有阴影，直接用全局阈值会把阴影误判成菌落。解决办法是顶帽变换：先做形态学开运算得到背景估计，再用原图减去背景。
se = strel('disk', 30); % 结构元素半径要大于菌落尺寸 background = imopen(denoised, se); corrected = imsubtract(denoised, background);顶帽变换的核心逻辑，是用一个比菌落大的结构元素去估算背景光照，然后扣掉它。挑结构元素半径的原则是：比最大的单个菌落直径还要大，但不能大到把整个培养皿都当成背景。我常用的值在20到50像素之间。
预处理做完后，你会发现菌落和背景的对比度明显拉开了，这时候再做二值化，阈值会好选得多。这里有一个我早期踩过的坑：如果直接用全局阈值去处理没校正光照的图像，会出现培养皿边缘一圈全是“假菌落”，怎么调阈值都顾此失彼。
2.2 二值化阈值的选择：固定阈值不够用
MATLAB里二值化最常用的就是imbinarize，默认用的是Otsu方法，它会自动寻找一个阈值，让前景和背景的类间方差最大。不过Otsu也有失效场景——如果前景（菌落）面积占比很小，或者背景有大面积渐变，全局阈值就可能把暗背景整个归成前景。这种情况我会切换到自适应阈值：
bw = imbinarize(corrected, 'adaptive', 'Sensitivity', 0.45);这里的Sensitivity参数控制分割灵敏度，越接近1，分出的前景越多，噪声也越多。我一般从0.4开始试，观察二值图里的菌落是否完整，如果菌落中间出现空洞就降低灵敏度，如果背景噪声点多就调高。
注意，二值化之后一定要看一下菌落内部是不是实心的。因为菌落经常是中间凸起、边缘薄，光照下中间会有一圈高光，二值化后反而出现“面包圈”现象，中间是空的。这种空心区域如果没有处理，后面计数会把一个菌落当两个。解决办法是在二值图基础上做“填充孔洞”：
bw_filled = imfill(bw, 'holes');这个操作会把所有完全被前景包围的背景区域填满，非常适合处理高光造成的空心。但注意不要对前一步的背景区域使用，否则会把培养皿内部噪声全部连成大片。
3. 粘连菌落的分割：距离变换与分水岭的配合
3.1 为什么直接数连通域不靠谱
做完二值化后，很多人会直接用bwlabel统计连通域数量，觉得任务就完成了。但菌落长得根本不是规则的圆，两个菌落挨得近的时候，二值图上就是一个不规则的大块，bwlabel数出来是1，而真实菌落数量是2。我一开始也这么干过，结果拿一份密集平板的图去数，出来32个，实际人工数了44个，误差接近三成。
要解决这个问题，就得把粘连区域切开。对规则圆形目标，最成熟的方法是“距离变换 + 分水岭”。先说距离变换的原理：对二值图里的每个前景像素，计算它到最近背景像素的距离。如果一个区域里有多个圆形目标，距离变换后每个目标的中心位置会是局部最大值，这个局部最大值就是“种子点”。找到种子点之后，分水岭算法会从每个种子点开始向周围扩展，直到碰到其他区域扩展出来的边界，从而形成分割线。
3.2 用MATLAB实现距离变换和分水岭的完整步骤
代码核心流程是这样的：
% 1. 对二值填充图做距离变换 D = bwdist(~bw_filled); % 2. 对距离图做H-minima变换，抑制不必要的局部极小值 D_suppressed = imhmin(D, minDepth); % 3. 找局部极大值作为前景标记 mask = imextendedmax(D_suppressed, 2); % 4. 强制在标记位置设置极小值点 D_mod = imimposemin(-D, mask); % 5. 分水岭分割 L = watershed(D_mod);这里最核心的参数是minDepth，也就是在H-minima变换里用来控制“多低的谷底才被算作一个独立目标”。如果设得太小，杂信号也会成为标记，导致过度分割，一个完整菌落被劈成三瓣；如果设得太大，真实粘连菌落合并成同一个标记，分不出来。我的经验是：minDepth取距离变换最大值的20%到30%左右比较稳，可以先用max(D(:))看看值域再定。
还有一个坑要注意：watershed处理的结果里，要排除背景区域（像素值为0的区域），因为背景也会被分水岭边界分割成很多小块。通常的做法是：
bw_labels = label2rgb(L, 'jet', [0 0 0]);或者直接对L做掩膜，把背景区域的标签设为0，只统计前景区域内的标签数。
我实际跑下来测过，对100个左右菌落的平板，距离变换分水岭能正确切开约九成以上的粘连体。剩下切不开的，基本是那种完全重叠、连人眼都要仔细分辨的深度粘连菌落，这种场景下可以考虑更复杂的凹点检测方法，但日常实验里觉得精度已经够用了。
4. 特征筛选与计数实现：别让杂质混进统计结果
4.1 用regionprops统计菌落数量和大小
经过前面几步，已经得到了一张分割好的标签图L，前景中每个独立的标签区域就代表一个菌落。接下来是计数和特征提取环节，核心函数是regionprops：
stats = regionprops(L, 'Area', 'Centroid', 'MajorAxisLength', 'MinorAxisLength'); num_colonies = length(stats);直接length(stats)就能得到菌落数。但这样不够严谨，因为二值图里可能混入培养基杂质、气泡边缘、掉落的碎屑。这些干扰物面积通常明显小于正常菌落，或者偏心度极高（长条形的划痕）。所以要做特征筛选。
4.2 面积、圆度和离心率筛选的经验值
我习惯设置三个筛选维度：面积下限、面积上限、离心率上限。面积下限是过滤小杂质的关键，一般取所有连通域面积中位数的五分之一。这个值不是拍脑袋定的，因为菌落尺寸分布相对均匀，真正的小杂质会远小于菌落，取中位数的比例能自适应地过滤掉它们。
离心率滤掉长条形划痕，公式是：
ecc = sqrt(1 - (MinorAxisLength / MajorAxisLength)^2);完整逻辑：
areas = [stats.Area]; eccs = sqrt(1 - ([stats.MinorAxisLength] ./ [stats.MajorAxisLength]).^2); valid_idx = areas > minArea & areas < maxArea & eccs < 0.9; filtered_stats = stats(valid_idx); num_colonies_final = length(filtered_stats);这里eccs < 0.9是一个比较宽松的值，因为圆形菌落的离心率接近0，长条划痕接近1。如果设置太严格，椭圆形的次级菌落会被误删，太宽松又滤不掉条状干扰。
还有一类特殊情况值得单独处理：如果菌落是彩色的，或者颜色差异明显，可以在RGB或HSV空间增加一个颜色特征。比如用mean(H)把某种色调的菌落单独挑出来，这在混合培养场景下很实用。代码上不复杂，就是每个连通域求色调均值，再加一个色调范围判断。
4.3 导出结果与可视化叠加
计数完成之后，建议把结果可视化出来，方便人工复核。画图方法很直接：
figure; imshow(img); hold on; for k = 1:num_colonies_final plot(filtered_stats(k).Centroid(1), filtered_stats(k).Centroid(2), 'ro'); text(filtered_stats(k).Centroid(1)+5, filtered_stats(k).Centroid(2), ... num2str(k), 'Color', 'yellow', 'FontSize', 8); end这样标好号的图可以直接存档，后续审稿或者汇报的时候能展示“每个被计数的目标都被标记了”，比单纯给一个总数说服力强很多。有人会用insertMarker或者insertText来实现，效果类似，但我习惯用plot，因为可以自由调整样式。
另外要提醒一件事：regionprops统计的结果是按照标签图的索引顺序排列的，如果你前面做过特征筛选，索引会错位。所以如果要把筛选结果和原连通域对应起来，一定要保留stats的原始索引信息，或者用bwlabel的n参数直接分组再统计。
5. 常见问题与排查技巧实录
5.1 培养皿边缘反光和阴影的干扰怎么处理
培养皿边缘那一圈弧形反光是我遇到最多的问题，二值化后经常会出现一个巨大的月牙形区域，面积比菌落大几十倍，完全干扰了regionprops的面积统计。解决办法有两个方向：一是在预处理阶段用imopen的背景估计法已经能去掉大部分均匀阴影，二是对边缘区域做掩膜扣除。后者的操作不复杂，提前圈出培养皿的有效区域（ROI），用poly2mask生成掩膜，在统计时只对掩膜内的连通域计数。我做了个简单版：
% 手动圈选ROI，也可以用自动找圆的方法 h = drawcircle(gca); mask = createMask(h); stats = regionprops(L .* mask, 'Area', 'Centroid');这种半自动ROI做法快，缺点是换一张图就得重新圈一次。批量处理时可以用imfindcircles先自动找培养皿边缘圆，把圆心和半径提取出来，再生成圆形掩膜，这样就能全自动处理一批图片。
5.2 菌落太小和背景太杂导致误检
如果菌落本身很小，比如长满了整个平板、菌落直径只有十几像素，中值滤波窗口稍微调大一点就会把菌落边缘模糊掉。我的经验是这种场景不要用5x5的滤波窗口，改用3x3，或者干脆不滤波，直接做顶帽变换。噪声点的问题靠后面的面积筛选解决，不要试图在第一阶段就全部滤干净，否则容易误伤目标。
背景太杂通常是培养基有颗粒物，或者拍摄时分辨率太高引入了纹理细节。这种情况下自适应阈值的Sensitivity要调小一点，让分割更保守，宁可少误检几个小的杂质，也不要把背景大块区域分割进来。还有一招是分水岭之前对二值图做bwareaopen，直接删掉面积小于某个阈值的连通域，能减少大量小噪声对分水岭的干扰。
5.3 光照不均导致菌落中间出现空洞
前面提过的高光空洞问题，在菌落表面反光明显时特别突出。我有一次处理表面湿润的平板，几乎所有菌落中间都有一个白色高光区，二值化后成了空心的环。填充空洞用的是imfill，但如果高光区域特别大，填充后菌落中间会残留一圈黑色边界痕迹，分水岭阶段又会把它当成边缘切开。
这种情况我的处理顺序是先做形态学闭运算，把小的裂缝补上：
se_close = strel('disk', 3); bw_closed = imclose(bw_filled, se_close);再对距离变换图做中值滤波平滑，减少内部局部极小值点。这套组合拳下来，空心导致的过分割基本可以消除。
5.4 处理显微镜下密集菌落时的参数调整
如果是显微镜照片或者涂抹视野，菌落目标非常密集，距离变换分水岭的参数要主动调宽。minDepth的相对比例要提高一些，imextendedmax里的阈值参数（上面代码里的2）要按距离图的最大值比例动态设置。我的代码里一般这样写：
maxDist = max(D(:)); minDepth = maxDist * 0.25; mask = imextendedmax(D, round(maxDist * 0.1));用动态比例而不是固定数值，是应对不同分辨率图像最省心的办法。另外，密集场景下regionprops的MinorAxisLength普遍偏小，面积筛选的下限要相应降低，否则会漏掉大量真实菌落。
最后再分享一个实用经验
整个项目做完，我自己最大的体会是：自动化计数的精度瓶颈往往不在算法，而在图像采集端。如果你拍照的时候光照均匀、培养皿放在纯色背景下、镜头垂直拍摄，后面算法的参数随便调调都能得到比较好的结果；反之，如果照片拍得东倒西歪、反光严重，那再优秀的算法也要靠参数硬扛。所以我建议有条件的实验室，先固定一个拍摄装置，哪怕是用手机支架加一个小补光灯，都能让后续所有图像处理工作省心一半。另外，分水岭的minDepth参数建议做个“参数扫描”脚本，自动尝试多个候选值，把每个值对应的计数结果输出到表格里，你对照人工计数选一个最佳值，这样既省时间又能找到最优参数。这也是我在后期批量处理上百张图片时，总结出的最实用的一招。
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