基于血浆的脑年龄作为认知健康和脑相关疾病风险的潜在生物标志物-平芜编程栈

摘要

背景理解大脑衰老对于识别早期认知衰退标志至关重要。本研究旨在开发基于血浆的脑部衰老生物标志物，并考察其与认知功能的关联。

方法我们使用了53,005名英国生物样本库参与者（2006–2010年）的数据，结合现有的Olink蛋白质组学数据（平均年龄57±8岁，女性占54%）。利用蛋白质水平估算脑年龄、生物体年龄及传统蛋白质组年龄，采用最小绝对收缩与选择算子（LASSO）回归法。我们利用多变量调整线性回归模型评估这些生物年龄与认知功能的关系，以及它们与阿尔茨海默病（AD）和中风发生率的关联，并使用Cox比例风险模型。在弗雷明翰心脏研究（FHS）子代队列（2002–2005年第8期考试，平均年龄67±9岁，女性55%）中，同样使用Olink平台验证了结果。

结果加速大脑衰老与认知表现较差显著相关，而有机体和传统蛋白质组年龄则无此关联。这三种生物年龄指标均与阿尔茨海默病和中风风险增加相关，但脑部衰老关联最强（阿尔茨海默病风险比（HR）：1.79 [95%置信区间（CI）：1.66–1.93]）;中风心率：1.25 [95% CI：1.17–1.33]）。在FHS验证中，脑部衰老与注意力和视觉记忆等认知领域的表现下降相关，并增加阿尔茨海默病风险（HR：1.64 [95% CI：1.37–1.97]）。

结论：基于血浆的脑部衰老生物标志物可能为监测认知健康和识别年龄相关疾病风险个体提供有前景的工具。

这项研究通过血液蛋白寻找脑部衰老的迹象及其与认知功能的联系。研究人员利用英国生物样本库中超过53,000人的蛋白质数据和机器学习技术，创建了不同的“生物年龄”评分。脑老化评分与认知表现较低以及阿尔茨海默病和中风风险增加密切相关。这些发现在弗雷明翰心脏研究中进行了测试，结果也类似——脑龄较大与记忆力下降和阿尔茨海默病风险增加有关。这表明，专注于脑部衰老的血液检测可以帮助医生早期发现认知衰退的迹象，并更早采取措施预防与年龄相关的疾病。

引言

随着全球人口老龄化，关于大脑衰老的研究变得至关重要，越来越多的人面临阿尔茨海默病（AD）等慢性疾病及其他神经退行性疾病的风险1。理解导致大脑衰老和认知衰退的生物过程对于开发早期诊断工具和生物标志物、有效干预措施及潜在治愈方法至关重要2。脑衰老可以通过多种方法评估，包括神经影像技术、认知评估、血液或脑脊液生物标志物，以及细胞或分子衰老标志物，如端粒长度和表观遗传时钟。早期检测通常依赖实验室检测;例如，阿尔茨海默默病与认知正常人群之间的生物标志物差异（如淀粉样蛋白-β）大约发生在认知衰退在阿尔茨海默病诊断出现前12年3。除了AD的这一标志外，基于血浆蛋白的生物年龄估计（如蛋白质组年龄钟）也可以作为AD4–6的预测因子。识别与衰老相关的蛋白质可能为阿尔茨海默病的早期诊断提供宝贵见解。识别与衰老相关的蛋白质对于深入了解大脑衰老过程也至关重要。蛋白质及其编码基因为大脑衰老背后的生物机制提供了见解7,8。例如，除了阿尔茨海默病的遗传定位外，蛋白质组学研究不仅验证了成熟的淀粉样蛋白和tau途径，还揭示了更广泛蛋白质网络中的其他成分。这些过程包括RNA剪接、神经发育、免疫反应、膜转运、脂质代谢、突触功能和线粒体活性等。开发精确的大脑蛋白质组衰老模型有助于识别与认知衰退易感性最相关的蛋白质，从而开发有针对性的早期干预措施并监测治疗效果10,11。多项大型人群研究（如英国生物样本库UKB）已证明蛋白质组年龄时钟是预测死亡率和发病率的可靠生物标志物4,5,12。然而，传统的蛋白质组年龄时钟估算方法未考虑不同器官和组织衰老速率的差异，从而忽视了全身的衰老异质性13。最近，专门的器官蛋白质组年龄钟被引入，用于在器官层面精细化衰老估计。虽然传统的蛋白质组衰老模型可能与多种疾病整体关联更强，但器官特异性衰老模型在预测特定器官疾病方面往往表现优于这些模型14–17。例如，大脑特异性衰老蛋白与阿尔茨海默症及相关痴呆症的关联性比其他器官相关蛋白更强。除了疾病结局外，大脑特异性衰老蛋白与阿尔茨海默病早期迹象（如记忆力衰退）之间的关联尚未被充分探讨，脑特异性衰老模型在认知功能评估中的可重复性和实用性也同样缺乏研究。该项目的目标是利用英国心脏研究所（UKB）的数据开发基于血浆的脑老化生物标志物，并在弗雷明翰心脏研究（FHS）中验证我们的发现。此外，我们还考察了大脑特异性衰老蛋白与认知功能及这两组潜在队列中年龄相关疾病风险之间的关联。我们观察到，基于血浆的脑年龄增加与认知表现下降相关——尤其是在注意力/注意力和记忆方面——并且患阿尔茨海默病的风险也更高。这些基于血浆的脑年龄与认知（AD）之间的关联比传统蛋白质组年龄观察到的更为显著。我们的发现凸显了基于等离子体的脑年龄作为监测认知健康和识别年龄相关疾病风险个体的有前景工具的潜力。

方法

研究队列

UKB是一项大规模前瞻性队列研究，涵盖了来自2006年至2010年间招募的502,505名居住在英国的参与者的综合遗传和表型数据。本分析重点关注UKB队列的一部分，特别是拥有Olink Explore蛋白质组学基线数据的参与者，最终形成了53,014名个体的研究样本7。弗雷明翰心脏研究（FHS）始于1948年，是一项成熟的社区基础前瞻性队列研究20。1971年，招募了“后代”群体，该群体由最初参与者的子女及其配偶组成21。后代群体经历了十轮健康检查，通常每四到六年进行一次，始于1971年至1975年的第一个周期。本研究分析了参与第八轮检查周期（2005–2008年）的2066名后代队列个体的数据，该周期采集血液样本以进行蛋白质组学分析。英国生物样本库研究是在NHS西北研究伦理委员会（21/NW/0157）作为研究组织库的通用伦理批准下进行的。该批准涵盖当前研究，无需额外的伦理审批。英国生物样本库资源对从事公共利益健康相关研究的正规研究人员开放（www.ukbiobank.ac.uk/register-apply/）。本研究使用英国生物样本库数据，申请号76269进行。FHS方案已获得波士顿大学医学中心机构审查委员会的批准。所有FHS参与者提供书面知情同意，用于收集和使用其数据和生物样本。

蛋白质组学剖面

在UKB研究中，2006年至2010年间的访视期间，从参与者收集了基线蛋白质组学数据。蛋白质组学分析涉及使用Olink Explore平台测量2923个蛋白质，该平台为每个蛋白质提供log2尺度的归一化蛋白表达（NPX）。为确保数据质量和可靠性，排除了12个缺失率超过20%的蛋白质，保留了2911个蛋白质以供进一步分析。对于剩余缺失蛋白，通过用从未缺失样本计算出的平均NPX值替换缺失值来进行补值8。对于FHS，蛋白质组学分析的方法论已在制造商官网（https://olink.com/ 知识/文档）中有详尽文档。简而言之，血浆样本在研究访问期间采集，并储存在−80°C的环境下，直到分析结果。蛋白质浓度通过Olink Explore HT平台进行测量。蛋白质浓度也以 log2 尺度的 NPX 测量。共分析了5,371种蛋白质。其中24个蛋白因为对照探针被排除，135个蛋白因在基因组织表达图谱（GTEx）中找不到被移除。其余5212个缺失率（缺失率<20%）及缺失值的蛋白质则通过其他未缺失样本的推值方法推断。此外，选取了UKB和FHS之间重叠且质量控制的2750个蛋白进行下游分析（补充图1）。

器官特异性蛋白的分配

利用GTEx v8的RNA测序数据分析了多种组织的基因表达22。组织按其器官分组（补充数据1），RNA测序读数使用DESeq223进行归一化。针对每个组织，计算了所有样本的平均归一化读数。器官层面的表达由各器官内组织的最大归一化平均值表示。为了识别器官富集基因，计算了折叠变化，即一个器官中最大表达水平与另一个器官第二高表达水平的比值。如果折叠变化超过4，则认为基因为有机丰富。生成了GTEx基因及其对应富集器官的列表（补充数据2）。随后，UKB和FHS Olink数据集中的质量控制蛋白被映射到GTEx基因，并分配到特定器官以供进一步分析。基于血浆的脑年龄蛋白被定义为编码基因在大脑中富集的蛋白质（补充数据2中以enrich_organ_yes=1映射到大脑的基因）。生物体蛋白被定义为编码基因跨多个器官表达的蛋白（补充数据2中enrich_organ_yes = 0）。常规年龄蛋白是UKB和FHS中通过质量控制的蛋白。未发现蛋白质在多个器官中富集（补充数据3，补充数据4）。在2750个重叠蛋白（即常规年龄蛋白）中，有102个（3.7%）为血浆基础脑年龄蛋白，2235个（81.3%）为生物体年龄蛋白（补充图1）。

认知及其他健康结果

UKB的参与者在评估中心的现场或在线随访中完成认知测试。使用了六项认知测试来评估不同领域25,26：用于语言和数值推理的流体智力（FI）、用于工作记忆的数值记忆（MEMN）、视觉陈述性记忆的配对匹配（MEMP）、处理速度的符号数字替换（SDS）、处理速度的反应时间（RT）以及执行功能的路径形成测试B（TMT B）。我们开发了一个通用认知评分，这是之前六个归一化认知测试分数分析中第一个未旋转的主成分27。部分测试的分数如其他地方所示进行了转换28。所有认知测试都与蛋白质检测（UKB）同时进行基线，2006年至2010年）。更高的认知分数意味着认知功能更好或更高。通过特定的UKB现场识别（补充数据5）定义了全因死亡率和六种常见慢性疾病（如糖尿病、心力衰竭、心肌梗死、心房颤动、卒中和阿尔茨海默病）。结果选择基于数据可用性和科学依据。由于FHS最初设计为基于社区的心血管研究队列，因此心血管事件被全面确定且有充分的统计。阿尔茨海默病、中风和全因死亡率被纳入其与血浆脑年龄的假设关联，同时将若干心脏相关结局作为负面对照，因为它们与血浆基础脑年龄直接关联的可能性较低。该设计不仅使我们能够评估基于血浆的脑年龄及其脑相关结局，还测试了脑年龄作为潜在生物标志物的特异性。 FHS后代的认知功能通过一系列针对多个认知领域的神经心理学（NP）测试进行了评估29。每项NP测试的细节在其他地方都有描述30。语言记忆的领域通过韦氏记忆量表III逻辑记忆（LM）测试确定/评估，作为即时回忆、延迟回忆和识别测试的平均得分（即LMi、LMd、LMr的平均得分）。语言学习通过配对联想学习（PAS）即时回忆测试和延迟回忆测试的平均值（即PASi平均分、PASd）获得，视觉记忆则通过多个视觉再现（VRi、VRd和VRr的平均得分）获得。使用了路径形成测试A（TMT A）和TMT B来评估注意力和专注力：应用了自然对数变换以规范TMT A和TMT B的分布。为保持解释一致性，转换后的值进一步重新签名，使得较高的TMT A或TMT B对应更好的任务表现31,32。其余的NP测试（WAISIII相似性子测试、波士顿命名测试（30题版本）和Hooper视觉组织测试）各自代表独特的认知领域（抽象推理、语言和视觉感知组织）32。对于多次NP检测的患者，我们使用最接近实验室检测和蛋白质测量时间的检测。较高的NP测试分数反映了认知表现的更好。 FHS中的不良事件，包括死亡、充血性心力衰竭、心肌梗死、心房颤动和中风，由3名研究者组成的小组根据预设标准进行裁决33。糖尿病的诊断方法包括空腹血糖≥126 mg/dL，或通过胰岛素或口服降血糖剂治疗34。阿兹海默病诊断基于NP检测结果、神经学检查、家庭访谈、FHS周期检查记录及/或由至少1名神经科医生和1名神经心理学家组成的小组根据标准研究标准审查的医院或养老院医疗记录的现有数据确定35

统计与可重复性

器官衰老模型。本研究采用随机抽样方法将UKB数据拆分为训练集（70%，n = 37,105）和测试集（30%，n = 15,900）。训练数据集拟合了最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归模型36，结果以年龄为结局，预测变量为每个蛋白质组（大脑、生物体或常规蛋白）及性别。超参数调优通过五重交叉验证选择最优正则化参数（λ），以最小化均方误差（MSE）。最终模型基于500次自助迭代得出，计算了这些迭代的平均预测年龄。然后将从训练集获得的系数应用到测试数据集上，平均预测年龄也在500个自助模式中同样计算。器官特异性衰老相关蛋白的功能富集分析。使用g：Profiler服务器（https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost）对不同年龄段选中的顶级蛋白进行了功能富集分析37。分析内容如下g：GOSt模块，带有默认查询设置，研究基因本体（GO）（生物过程、分子功能、细胞成分）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、Reactome和WikiPathways中的通路。通过g：SCS算法校正了对富集P值的多次检测，该算法考虑了功能注释基因集的不均匀分布38。

计算单个器官的年龄差。通过线性回归将预测的器官年龄与年龄进行对比，以评估其关系。年龄差距定义为预测器官年龄与基于时间年龄的线性回归估计之间的残余差异17,39。该计算分别针对训练数据集和测试数据集进行。

器官年龄差距与结局的关联。虽然训练/测试的分配保持在年龄模型开发中以减少器官年龄估计的过拟合，但为实现下游关联分析，以最大化样本量并增强统计能力（n = 53,004）。开发了线性回归模型，以考察年龄差距与每个标准化认知评分之间的关联。模型调整了年龄、性别、吸烟状况、身体质量指数（BMI）、体育活动、饮食、酒精摄入、学业年限、高血压和APOE4等位基因剂量。关于这些协变量的更多细节，之前的研究中提供了40。使用Cox比例风险模型评估器官年龄差距与事件结局发展之间的关系，排除了常见病例。Cox模型中包含了与线性回归模型相似的协变量。我们还应用了时间分层Cox模型，在中位随访时间点对分层进行分层，即比例危害假设被违反。在次级分析中，参与者进一步分为三组：正常年龄组，定义为预测年龄差距在人口平均值两个标准差范围内;加速衰老，定义为预测年龄差距比平均值高出两个标准差以上;以及减缓衰老，定义为预测年龄差距低于平均值超过两个标准差。使用多变量调整的Kaplan-Meier（KM）曲线，展示了随访期间不同老龄群体中选定结局（即全因死亡率、中风和阿尔茨海病）的累计风险。

FHS中器官年龄差距与结局的关联。FHS后代队列对器官年龄模型进行了外部验证。FHS中的器官年龄是利用UKB训练的LASSO模型的回归系数计算的。由于FHS参与者（平均年龄=67岁）平均比UKB参与者（平均年龄=57岁）大10岁，我们通过调整LASSO回归中的截距项重新校准模型，以更好地对应FHS41中的预测年龄与实际年龄。器官衰老模型的可重复性作为FHS的二次分析进一步评估。使用完整的FHS样本（n = 2066），我们采用了与UKB类似的分析策略，包括器官年龄建模和年龄差距计算，训练与检测比例为70：30。LASSO 回归模型以时间年龄为结果，采用五重交叉验证进行超参数调优，并在训练集中进行 500 次自助迭代。器官特定年龄定义为500次自助计划中预测的平均年龄。年龄差随后作为器官年龄与时间年龄的残余计算，并在训练组和测试组中分别估算。为验证年龄差与NP测试域之间的关联，我们使用线性回归模型，调整了NP测试年龄、性别、吸烟、BMI、教育年限、高血压和APOE4等位基因剂量。为验证年龄差距与目标结局之间的关联，我们采用了多变量调整的Cox比例风险模型，并根据蛋白质组学年龄、性别、吸烟、BMI、高血压和教育年份进行了调整。本研究的分析框架如图1所示。所有分析均使用R软件版本4.2.1（https://www.rproject.org/）和Python版本3.6.8（https://www.python.org/）完成。

图1 |脑部特定年龄与健康结果的分析框架。整体研究设计包括三个部分：识别器官特异性蛋白。我们绘制了带有相应基因的蛋白质，并根据GTEX v8 RNA测序数据中该基因在某一器官的表达水平是否高出其他器官的四倍，将每个蛋白指定为器官特异性。英国生物样本库（UKB）和弗雷明翰心脏研究（FHS）共有2750种常规蛋白重叠。其中2235为生物蛋白，102为血浆脑蛋白。b 利用血浆蛋白预测年龄。我们将UKB分为训练数据集和测试数据集（7：3比例）。在训练集（N = 37,105）中，500个自助聚合LASSO回归模型进行了五重交叉验证，既适配了基于血浆的脑蛋白，也适用于有机体和常规蛋白。器官年龄是500次自举中预测的平均年龄。年龄差距是器官年龄的残余和基于年代年龄的线性回归估计。LASSO模型应用于UKB测试集（N=15,900），以估算器官年龄差距。外部验证和重复已在FHS后代检查8队列（N=2066）中进行，UKB训练的LASSO模型在FHS中重新校准，以估算年龄差距作为外部验证;而类似的分析策略（如训练/测试分离比例为7：3,500个自助LASSO模型）也在FHS中作为复制分析被实施。c 将年龄差距与健康结果联系起来。在UKB（结合训练和测试）和FHS中，我们使用线性回归模型观察器官衰老与认知功能的关联，并拟合Cox比例风险模型检验器官衰老与死亡及其他结局的关联。用 BioRender.com 制作的模型。

结果

队列描述

表1分别展示了英国大学和联邦公共服务学院参与者的特征。在英国地区，拥有基线蛋白质组学数据的参与者被随机分配为训练组和测试组，比例为7：3。UKB队列的平均年龄为57岁，女性占样本的54%。FHS参与者的平均年龄为67岁，其中55.3%为女性。FHS中服用抗高血压药物的参与者比例高于UKB（51%对22%）。

年龄与器官年龄预测的相关性

“传统”衰老模型共包含2750个UKB和FHS重叠蛋白。其中2235个被纳入“有机体”衰老模型，其余蛋白质则为器官特异性。在英国版中，时间年龄与传统和有机体衰老模型之间的相关性均超过0.9。时间年龄与三种年龄指标之间的相关性详见补充数据6。传统衰老模型预测年龄的均方根误差最低（UKB训练和测试分别为2.90和3.07）。而大脑衰老模型在三种衰老模型（脑特异性、有机体型和常规型）中最高（英国版为5.75和5.81）。同样，这三个年龄增长模型也被重新校准到FHS队列，其与实际年龄的相关性从中等到高不等（皮尔逊r = 0.68–0.90;补充数据 6）。此外，在UKB训练集中，500次自助式LASSO迭代中至少90%（≥450次）被选中的蛋白质列于补充数据7中。

器官特异年龄差的变异与相关性

年龄差作为器官特定年龄对时间年龄进行简单线性回归的残差计算。虽然所有模型的平均年龄差距接近为零，但其变异性存在差异。脑特异性年龄差较高（~4年），而生物体和常规年龄差的标准差较低（低于3年）。此外，常规年龄差与生物体年龄差之间存在强相关性（皮尔逊r = 0.91）（见图2）。原始年龄差距定义为预测年龄减去时间年龄的差值及其分布，已在补充图2中显示。

大脑衰老与认知功能的关联

图2展示了各器官衰老测量与认知测试分数之间的相关性。如表2所示，基于血浆的脑老化与所有六项认知测试均呈反相关，其中反应时间（效应大小 = −0.04,95% CI = −0.05至−0.02，P = 2.54 × 10−15）、数值记忆（效应值 = −0.04,95% CI = −0.05至−0.02，P = 3.12 × 10−5）和符号数字替换测试（效应值 = −0.04， 95% CI = −0.05至−0.02，P = 9.06 ×10−5）。此外，脑部衰老与一般认知得分相关（效应值 = −0.03,95% CI = −0.05至−0.01，P = 0.002）。相比之下，生物老化仅与反应时间相关（效应大小=−0.03,95% CI = = −0.03至−0.02，P=5.95×10−8）经过多次测试校正。常规年龄与反应时间（效应量=−0.02,95% CI = −0.03至−0.02，P=7.17×10−8）和符号数字替换检验相关（效应量 = −0.03,95% CI = −0.04至−0.01，P = 0.003）在多项检测校正后。

大脑衰老与健康结果的关联

如表3所示，基于血浆的脑老化与所有选定结局显著相关，其中全因死亡率和阿尔茨海默病的关联最为显著。脑部衰老增加一个标准差，对应于全因死亡风险增加50%（HR = 1.50,95% CI：1.46–1.55），阿尔茨海默病风险增加79%（HR = 1.79,95% CI：1.66–1.93）。同样，生物体衰老和常规衰老与所有选定结局相关，尽管相关性略有减弱。时间分层Cox模型的敏感性分析与原始Cox模型观察到的关联高度一致（补充数据8）。为了进一步探讨这些关系，我们将参与者分为加速衰老组、正常衰老组和减缓衰老组。与正常衰老相比，加速脑衰老与所有选定结局的风险较高相关（图3a，补充数据9），而大脑衰老减缓则风险较低（图3b，补充数据9）。生物体和常规老化也观察到类似趋势，但风险比较低。为评估全因死亡和脑相关疾病的累计风险（即绝对风险），我们使用多变量调整KM图显示极端衰老组与正常衰老组在随访时间内不良事件发生的概率（见图4）。与大脑、有机体和传统衰老模型中，加速衰老组的长期（如15年）死亡、阿尔茨海默病发展或中风发展概率显著高于正常或减缓衰老组（对数检验P值均小于0.05）。加速脑衰老者的长期死亡概率高达30%，15年内中风或阿尔茨海病的几率均超过5%，而处于有机体或常规加速衰老组的人群约为4%。

FHS中的验证与复制

我们在FHS中进一步验证了我们的发现。表4展示了大脑衰老与不同NP检验的关联。大多数NP检测在多次检测校正后与大脑衰老相关，波士顿命名测试除外。脑部衰老与注意力和注意力之间的最显著关联，通过Trail Making测试A和B进行了测试（多变量调整效应量=−0.10,95% CI = −0.14至−0.06，P=8.77 × 10−8）。注意力和注意力在名义上也与生物体衰老相关，且在多次检测校正后仍与传统衰老显著相关（效应量=−0.07,95% CI = −0.11至−0.04，P=8.58×10−5）。如表5所示，FHS中基于血浆的脑年龄与全因死亡率和阿尔茨海默病呈正且显著相关。脑部衰老增加一个标准差，对应于全因死亡风险增加45%（HR = 1.45,95% CI： 1.31–1.58），阿尔茨海默病风险增加64%（HR = 1.64,95% CI：1.37–1.97）。同样，常规衰老与两个结局及心力衰竭相关（HR = 1.41,95% CI： 1.15-1.73），而常规衰老与死亡率和心力衰竭相关，但与阿尔茨海默病无关（HR = 1.13， 95% CI： 0.95–1.34）。当我们在FHS中重现器官年龄估计过程时，FHS训练集中500次自助LASSO迭代中至少90%（≥450）中被选中的蛋白质数量远少于UKB训练集，尽管该平台覆盖了超过5000种蛋白质（补充数据10）。基于血浆的脑年龄与时间年龄的相关性在训练组和测试组中分别为0.79和0.76，略低于生物体或常规年龄与年龄之间的相关性（Pearson r = 0.87-0.93）。与FHS外部验证结果不同，重现的脑年龄与语言记忆无显著关联（效应大小=−0.05,95% CI = −0.09至−0.01，P=0.02），但与语言领域相关且多重测试调整（效应值=−0.08,95% CI = −0.12至−0.04，P = 2.96 × 10-4，补充数据11）。随着血浆脑年龄增加1-SD，患阿尔茨海默病的风险也随之增加（HR = 1.68,95% CI：1.44–1.96）。与此同时，死亡风险随着血浆脑部、生物体或常规年龄的增加而增加（心率范围在1.46到1.61之间）。上述三种器官衰老与糖尿病、心肌梗死或中风之间未发现显著关联（补充数据12）。

构成脑衰老预测因子的蛋白质功能分析

我们进行了通路富集分析，以探讨蛋白质对血浆脑年龄预测因子的潜在功能。如补充数据13所示，许多蛋白质参与突触通路，包括KEGG突触囊泡循环（多重测试调整后P = 2.63×10-4）及反应组通路

图3 |英国生物样本库中极端衰老与正常衰老不良事件的发生风险（N = 53,005）。a 加速衰老与正常衰老的风险比（HR），b 减缓衰老与正常衰老的风险比。气泡图的x轴显示了Cox模型中极端衰老组与正常衰老组的心率，并根据年龄、性别、吸烟、BMI、体育活动、饮食、酒精摄入、教育年限、高血压和APOE4等位基因剂量进行了调整。气泡的大小代表显著水平（即 -log10（P））。蛋白质组年龄名称，除了气泡外，显示了蛋白质组年龄与Bonferroni校正后不良事件之间的显著关联（双侧P < 0.05/7 = 0.007）。详细的效应量和P值（双侧）见补充数据9。跨化学突触和神经系统传递（多次检测调整后分别为P=4.51×10⁻⁻6和8.40×10⁻⁻6）。相比之下，与生物体或传统蛋白质组年龄相关的通路主要参与细胞表面受体信号传导、细胞因子-细胞因子受体相互作用、免疫系统以及细胞外基质组织。

图4 |英国生物样本库中加速、减缓和正常衰老组的多变量调整Kaplan-Meier图（N = 53,005）。a–i 是基于血浆的脑、有机体和常规衰老组的全因死亡、中风和阿尔茨海默病的累计风险。多变量KaplanMeier（KM）图已调整年龄、性别、吸烟、BMI、体育活动、饮食、酒精摄入、教育年龄及APOE4等位基因剂量。P值通过对数秩检验（双侧）计算。

讨论

本研究开发了一种针对大脑的衰老蛋白质组时钟，并在两个前瞻性队列中评估了其与认知功能及年龄相关慢性疾病的关联。我们的发现表明，加速脑部衰老与认知表现下降以及某些与衰老相关的结局风险增加相关，包括全因死亡和阿尔茨海默病。此外，我们的发现凸显了蛋白质组脑钟作为监测整体健康和识别高风险人群的潜在工具。血浆蛋白已成为年龄相关疾病的宝贵生物标志物，特别是疾病风险分层，英国生物样本库中的多项研究提供了支持证据4,12,14,16。基于血浆的脑年龄——定义为基于脑特异性蛋白的预测年龄之间的时间差，使用如LASSO或XGBoost14,16方法，已被诊断为阿尔茨海默病发作和死亡率。与此同时，其他研究者提出了蛋白质组时钟，即一组蛋白质，利用Cox模型直接预测死亡率和与年龄相关的疾病4,12。在我们的研究中，我们使用了一种基于LASSO的血浆脑年龄测量，作为认知功能和年龄相关疾病结局的预测因子。由于认知障碍通常比临床阿尔茨海默病诊断早数年，我们的发现表明基于血浆的脑龄与阿尔茨海默病早期迹象相关，可能成为减缓疾病进展的潜在治疗靶点。我们工作的另一个优势是将FHS作为外部验证和复制队列使用，使用Olink HT平台，平均比我们早10年，从而增强了结果的稳健性和普遍性。

与以往研究相比，我们确认基于血浆的脑年龄现象普遍存在，不仅表现为脑相关疾病患者的晚期衰老，也体现在影响其他系统疾病（如心脏）的人群6。我们发现大脑减速衰老与较低的死亡概率相关，进一步支持了年轻大脑和免疫系统促进无病寿命的观点14。此外，我们的发现表明认知功能受到大脑特异性衰老蛋白以及更广泛与衰老相关蛋白质的显著影响。这表明一种更系统的衰老方法，生物体衰老蛋白也可能影响认知功能，尤其是在注意力和专注领域。这一现象可能源于蛋白质间相互作用或器官间的分子通信42–44，强调了反映不同衰老表型的共享蛋白质组生物标志物的存在。传统风险因素，如饮食和吸烟，与蛋白质组特异性脑部衰老有关。吸烟和饮酒与大脑加速衰老相关，而剧烈的体育活动或健康饮食（如多吃蔬菜、少喝含糖饮料）则与大脑衰老“变慢”或延迟有关14,15。针对多种可调节传统风险因素的生活方式干预措施可能有益于大脑健康，提升认知表现，最终帮助预防与年龄相关的疾病 45,46。基于血浆的脑年龄蛋白功能分析强调了突触囊泡循环、化学突触间传递以及神经系统通路在认知功能和疾病发展中的参与。由于大多数脑特异性蛋白（102个中有96个）被纳入富集分析，结果未能确定少数有前景的治疗靶点，也未能缩小与减缓脑衰老相关的通路。为了进一步深入了解，我们考察了对脑年龄模型贡献最主要的三种蛋白质：髓鞘寡突胶质细胞糖蛋白（MOG）、神经丝轻链（NEFL）和短锥蛋白（BCAN）。MOG与髓鞘损伤及随后的神经元和轴突退化有关47，这些过程是AD认知障碍的基础。NEFL与APOE4遗传状态相关，是神经退行性退行的可靠标志物48–50。BCAN与衰老过程中细胞外基质的改变有关，影响多个皮层和皮层下结构51,52，这也可能导致认知能力下降。大脑特异性蛋白影响认知功能的另一个潜在机制是表观遗传变化。先前研究表明，一些与年龄相关的DNA甲基化位点具有组织特异性53,54，这表明表观遗传与蛋白质组衰老时钟在调节大脑健康方面可能相互作用。相比之下，生物体蛋白富含细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞粘附、细胞表面受体信号通路，表明大脑及其他器官衰老背后的共享分子机制。此外，一项涵盖衰老小鼠大脑生命周期的单细胞空间转录组图谱揭示了与大脑衰老相关的复杂细胞变化和细胞间相互作用55。此类研究可能揭示非器官特异性衰老蛋白如何通过细胞间相互作用及更广泛的系统性衰老过程促进大脑衰老。脑部特异性衰老测量的临床应用有望推动研究进展，因为人类血浆易于获取，蛋白质组学检测的成本预计将随着技术进步降低。此外，脑年龄模型的计算负担相对较低，因为它们是通过线性组合构建的。在临床环境中实施脑年龄评估有助于识别无疾病但因脑加速衰老而有高认知能力下降风险的中年人56。除了作为衰老生物标志物外，脑特异性蛋白质组学还促进了疾病相关蛋白及其翻译后修饰的鉴定，为治疗干预提供了潜在的新药物靶点57,58。针对大脑特异性生物标志物的早期干预或药物靶向可以帮助减缓衰老过程，预防与年龄相关的疾病59。

我们承认当前研究存在若干局限性。首先，我们利用GTEX mRNA表达数据定义了大脑特异性蛋白。GTEX样本年龄从20岁到70岁不等，超过三分之二年龄超过50岁，大多数患有心脏或脑血管疾病等慢性疾病。因此，器官间的相对基因表达水平可能受到衰老和疾病状况的影响。然而，以往的研究已证明GTEX衍生的器官特异性定义的可行性和可接受性15,17。其次，我们的衰老模型是在Olink平台上使用约3,000个血浆蛋白开发的，验证对象包括FHS中通过Olink HT平台测量的约2700个蛋白质。鉴于样本量较小，仅约2000名参与者，该验证队列可能略显弱势。通过纳入更广泛的蛋白质，这些蛋白质组衰老模型的准确性和稳健性有望得到提升。此外，我们的脑老化模型尚未与现有基于血液的神经退行性疾病生物标志物预测模型进行比较。第三，尽管我们在开发衰老模型时调整了性别，但大脑衰老的性别差异尚未被探索。第四，横断面评估了大脑衰老与认知功能的关联。未来需要结合重复认知评估和蛋白质组学的纵向研究，以更好地理解时间关系。最后，我们使用的研究人群主要是欧洲血统。因此，有必要在多种族/族裔群体中进一步验证，以评估我们发现的普遍性。