一、获取已知引物-- PrimerBank
链接：PrimerBank
1、选择Keyword；物种可选所有种类或人或鼠；输入目标基因名；
点击Submit。
注：若是不确定准确人源基因名，可在HGNC（人类基因官方命名库）查询。Home | HUGO Gene Nomenclature Committee
2、出结果：
Amplicon Size 137=扩增子长度 137 bp（一般qPCR 理想区间（80–150bp），稍扩大范围也是可以的）；
下方红框分别是前后引物的序列（可以直接发给公司来做）、Length长度（推荐18–24 nt，最常用最优：20–22 nt）、Tm解链温度（一般是58-62℃，前后引物的Tm差越小越好）。
注：要注意确认Gene Descriptions的信息（是否是你的目的基因），此图仅为展示。
3、验证引物--Primer-BLAST
在NCBI中的BLAST中验证初步引物特异性。点击这个链接BLAST: Basic Local Alignment Search Tool，进入页面往下滑，得下图，选择Primer-BLAST。
接着进入下图这个界面。先分别输入从PrimerBank中得到的前后引物序列（注意不要搞错顺序）；接着修改PCR product size一般为70-200bp（适用于qPCR）；Tm温度可修改为58-62℃，Max Tm difference也修改为2；
将页面往下滑到Advanced paramsters的设置中，得下图：将Primer Size修改为18-25nt（若是＜18则特异性差，容易乱结合；＞25则Tm 容易过高，二级结构风险上升如发卡结构）；将Primer GC content修改为40-60（GC 太低则引物结合力弱，Tm 偏低；GC＞60%则容易形成发夹、引物二聚体，非特异扩增变多）。其他保持默认。
接着滑到页面最底部，勾选Show results in a new window，点击Get Primers。
出现以下界面，等待一会儿，等运行完成，点击Check。
进入下图的界面，首先看Products on target templates的区域（列着不同的 mRNA 转录本），看扩增产物是否都为目标基因的产物，若是出现不同基因的产物则说明引物特异性不佳，最好换一个（但是有一个特殊情况：若是那个不同基因的产物size五六百总之与目标基因的差好几百，影响就没那么大，但也是有一些影响的）。
再看看引物的基本信息作为参考，Self complementaritySelf 和3' complementarity是指自互补性与 3'端互补性，数值越小越好，说明：引物自身形成发夹结构、或两条引物互相结合形成“引物二聚体”的概率都很低，不会严重干扰目标序列的结合。
若是扩增产物都为目标基因的产物，以及引物的基本信息符合qPCR的标准，那么这对引物序列就可以发给相应公司制作，随后再做分子实验进行进一步的验证。
二、设计引物--Primer3Plus
若是在PrimerBank没有目标基因的引物序列或是特异性太差等原因，则可以自己设计引物的序列。
1、确认目的基因的转录本序列:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/
进入网页后检索目的基因，选择符合要求的目的基因的条目，注意基因的来源是什么动物，一般排在前面的匹配度较高。
进入下一个页面后，可以看到这个基因的基本信息，一直下滑到其mRNA and Protein的栏目，点击第一个转录本，一般排在前面转录本的优先级更高，更推荐使用。REVIEWED表示由人工审核过，更加可信。
进入这个转录本的网页后，可以简单看看相关信息，往下滑先点击CDS如下图，随后页面自动去到基因序列；
如下图，复制其高亮的部分。
2、进行引物设计：
进入Primer3Plus - Pick Primers这个网站。将settings选择为qPCR；在Main中将前面复制的序列粘贴到指定区域，如下图。
接着在中间栏点击General Settings设置参数：Product Size Ranges改为70-200；Primer Size为18-25；Primer Tm为58-62；Max Tm Difference改为2；Primer GC%为40-60；其他保持默认。最后点击绿色按钮Pick Primer。
出结果：可以看看这两个引物的基本情况是否适合，一般首先出现的引物是算法综合评分高的，推荐使用的引物，若是不满意也可以点击Next Primer Pair查看下一组引物。
确定引物后复制前后引物的序列进行特异性的验证。
3、验证引物--Primer-BLAST
与前文的验证引物的方法一致，这里不赘述。最后再进行分子实验验证。
参考：
如何设计qPCR引物序列_self complementarity-CSDN博客
【经验分享】NCBI设计引物——最详细说明及教程！！！适合0基础~-CSDN博客
https://www.bilibili.com/video/BV16B4y1u732/?spm_id_from=333.337.search-card.all.click
若有出错，恳请指正
