一、为什么需要计算抗体的理化性质？
在前面的教程中，我们已经利用Protein Contacts分析了抗原–抗体结合界面的相互作用，并通过Protein Surface和Protein Patches研究了抗体表面的静电与疏水性质。
这些分析可以帮助我们理解抗体如何识别抗原，但抗体药物的优化不仅需要关注结合能力，还需要考虑其自身的理化性质。
例如，一个抗体可能具有良好的抗原结合能力，却由于存在较大的暴露疏水区域、容易发生化学修饰的残基或不理想的电荷分布，而表现出较差的溶解性、稳定性或较高的聚集倾向。
因此，在抗体理性设计中，我们还需要进一步分析：
抗体表面哪些残基具有较高的溶剂暴露程度？
哪些残基可能存在氧化等化学稳定性风险？
抗体的疏水性与电荷分布是否存在潜在问题？
如何结合残基性质与结合界面信息筛选值得突变的位点？
MOE提供的Protein Properties功能能够计算蛋白质整体及单个氨基酸残基的多种理化性质，帮助我们从分子结构出发识别潜在的优化位点。
二、Protein Properties能够计算哪些性质？
Protein Properties主要提供两类计算结果：
整体蛋白质性质（Protein-level Properties）：描述整个蛋白质分子的理化特征。
残基水平性质（Residue-level Properties）：描述单个氨基酸残基的局部性质。
常见的分析指标包括：
| 性质 | 含义 | 在抗体设计中的作用 |
|---|---|---|
| Solvent Accessible Surface Area（SASA） | 溶剂可接触的分子表面积 | 分析蛋白质表面暴露情况 |
| Residue Exposure（res_exp） | 单个残基的相对暴露程度 | 筛选高度暴露的残基 |
| Hydrophobic Patch Area | 疏水Patch的表面积 | 评价潜在的疏水表面风险 |
| Electrostatic Patch Area | 正、负静电Patch的面积 | 分析抗体表面电荷分布 |
| Net Charge | 蛋白质的净电荷 | 辅助分析电荷性质及pH依赖性 |
| Residue pKa | 可电离残基的酸碱平衡特征 | 研究局部质子化状态 |
其中，具体可以计算哪些性质，取决于所使用的MOE版本、计算对象及所选参数。
对于本篇的研究目标，我们重点关注残基溶剂暴露程度（res_exp）。
2.1 什么是溶剂可及表面积？
溶剂可及表面积（Solvent Accessible Surface Area，SASA）用于描述蛋白质表面能够被溶剂接触的面积。
这一概念通常通过一个代表溶剂分子的探针在蛋白质表面滚动来定义。
位于蛋白质内部的残基通常具有较小的溶剂可及表面积，而暴露在蛋白质外部的残基通常具有较大的溶剂可及表面积。
例如，在抗体结构中：
埋藏于Framework内部的某些疏水残基通常具有较低的溶剂暴露程度。
位于CDR环区表面的残基则可能具有较高的溶剂暴露程度。
需要注意，SASA描述的是溶剂能够接触的表面积，并不直接表示某个残基是否参与抗原结合。
2.2 为什么要关注残基暴露程度？
残基的溶剂暴露程度与其化学环境密切相关。
例如，Met（甲硫氨酸）侧链中的硫醚基团可能发生氧化，而其氧化倾向受到局部溶剂环境和结构特征的影响。
对于一个高度暴露的Met残基，如果它同时位于抗体的重要功能区域，就可能成为需要关注的化学稳定性风险位点。
类似地，其他可能发生化学修饰的残基也可以结合暴露程度和局部结构进行分析。
但是，高溶剂暴露本身并不代表某个残基一定存在开发风险。还需要考虑氨基酸类型、局部环境以及其对抗体结构和功能的影响。
三、使用MOE计算抗体的Protein Properties
步骤1：加载并准备抗体结构
首先打开经过QuickPrep处理的3G6D复合物。
MOE | RHS | Open
本次计算主要研究CNTO607抗体自身的理化性质，因此需要排除IL-13抗原对计算对象的影响。
在System Manager中找到抗原链：
3G6D.A
将其设置为Inactive状态，同时隐藏抗原的显示。
保留抗体重链和轻链作为当前的分析对象。
需要注意，仅仅隐藏抗原的Ribbon不一定意味着该链被排除在计算之外，因此应检查对应的激活状态。
步骤2：打开Protein Properties
在MOE主菜单中选择：
MOE | Protein | Properties...
随后打开Protein Properties面板。
在该面板中，可以看到两个主要功能区域：
Property Calculation
用于选择需要计算的性质、设置计算对象和环境条件，并启动性质计算。
Property Viewer
用于查看计算结果，包括整体性质、残基性质及部分指标随环境条件变化的结果。
在课程示例使用的MOE界面中，Protein Properties提供112项可选性质，其中默认选择28项进行计算。不同版本的具体数量可能有所变化。
步骤3：设置计算参数
在Property Calculation面板中，首先检查Source是否设置为当前MOE窗口中的结构。
随后确认需要计算的性质。
对于本次案例，可以保留默认选择的性质，并重点关注与残基暴露和疏水性相关的指标。
此外，Protein Properties还可以设置计算环境，例如：
pH
Temperature
Salt Concentration
这些参数可能影响蛋白质的质子化状态、电荷分布及部分性质计算结果。
本篇以单个结构的基础性质分析为主，可以使用当前默认条件完成计算。
如果后续需要比较不同pH条件下的蛋白质性质，则需要进一步设置相应的计算条件。
步骤4：运行Protein Properties计算
确认计算对象和性质后，点击：
Calculate
MOE会对当前选定的蛋白质结构进行性质计算。
计算完成后，结果将显示在Property Viewer中。
通过结果列表，可以查看已计算的整体蛋白质性质，包括不同表面Patch相关指标和其他理化性质。
四、使用Residue Table分析单个氨基酸的性质
蛋白质整体性质可以反映抗体的总体特征，但在实际突变设计中，我们还需要知道具体哪些氨基酸残基可能存在优化空间。
因此，本篇的重点是Protein Properties中的Residue Table功能。
步骤5：打开Residue Table
在Property Viewer中点击：
Residue Table
MOE将显示蛋白质各个残基的性质计算结果。
表格中包含残基所属蛋白链、残基名称及不同性质指标。
通过这个功能，我们可以对残基进行排序、筛选，并将选中的残基与MOE三维结构关联。
步骤6：按照res_exp排序
在Residue Table中找到：
res_exp
这一字段用于描述残基的相对溶剂暴露程度。
点击res_exp列标题，对残基按照暴露程度进行排序。
在示例操作中，可以通过点击两次使其按照降序排列。
随后点击：
Res
按照氨基酸类型进行排序。
这样可以将相同类型的氨基酸集中显示，并根据其溶剂暴露程度进行比较。
例如，可以将所有Met残基集中查看，比较不同Met在蛋白质中的暴露程度。
这里需要注意，res_exp属于相对暴露性质，不能直接与以Ų表示的绝对SASA数值混用。不同性质字段的具体定义与数值范围，应以MOE相应属性说明为准。
五、案例分析：为什么Met92是值得关注的优化位点？
步骤7：寻找Met92
在Residue Table中滚动至Met（MET）残基所在的位置。
找到抗体轻链中的：
MET92
在当前3G6D结构中，Met92位于抗体的CDR-L3区域。
选择MET92所在的记录，然后点击：
Select
随后关闭Residue Table，并使用MOE主界面右侧的：
Center
将三维视角调整至Met92所在的位置。
从计算结果可以观察到，Met92具有较高的残基暴露程度，说明其侧链在当前结构中具有较高的溶剂可接触性。
5.1 为什么Met92可能存在氧化风险？
甲硫氨酸（Methionine，Met）是一种含硫氨基酸，其侧链中包含硫醚基团。
在一定条件下，Met侧链可能发生氧化，形成甲硫氨酸亚砜等氧化产物。
对于治疗性抗体，Met氧化可能影响局部结构、稳定性或生物学活性，具体影响取决于该残基所处的位置和环境。
在CNTO607中，Met92具有两个值得关注的特征：
位于CDR-L3，靠近抗原结合区域。
具有较高的溶剂暴露程度，可能存在氧化相关的开发风险。
因此，Met92可以作为潜在的抗体优化位点进行进一步研究。
但是，需要强调，Protein Properties不能直接预测Met92在实际制剂条件下的氧化速率。当前结果主要用于提示可能存在的结构风险，并不意味着Met92一定会发生严重氧化。
步骤8：结合抗原表面分析Met92的局部环境
仅凭Met92的溶剂暴露程度，还不足以判断应该如何进行突变。
由于Met92位于抗原结合区域，我们还需要进一步检查该残基与IL-13之间的相互作用。
首先，在System Manager中重新显示并激活IL-13抗原链：
3G6D.A
随后利用之前介绍的Protein Surface功能，生成抗原表面，并将Color设置为：
Lipophilicity
通过观察可以发现，Met92所接触的IL-13局部表面具有较强的亲水特征。
这说明，Met92的非极性侧链与抗原局部环境之间可能存在优化空间。
例如，可以考虑将Met92替换为具有一定极性的残基，并进一步评价替换后的氢键网络、结合评分和稳定性。
不过，选择更极性的氨基酸并不一定能够改善结合亲和力，因为突变还可能引起侧链构象、去溶剂化和局部相互作用网络的变化。
步骤9：使用SiteView观察Met92的局部环境
为了更加清楚地观察Met92附近的残基，可以先清除不需要的Surface和Patch对象，避免其遮挡局部结构。
随后选中Met92，点击MOE右侧工具栏中的：
SiteView
MOE将视角调整至所选残基附近，并显示其周围的局部结构。
在该区域，可以进一步观察Met92与抗原邻近残基的空间关系，例如Asn19和Asn23等残基。
这些局部结构信息可以帮助我们判断，如果将Met92替换为其他氨基酸，是否可能形成新的极性相互作用。
六、如何利用Protein Properties筛选抗体优化位点？
通过Met92的案例，可以将残基性质分析总结为一个较为通用的思路。
首先，利用Protein Properties计算残基性质。
例如，使用res_exp筛选具有较高溶剂暴露程度的残基。
其次，根据残基类型判断潜在风险。
对于Met等具有潜在化学修饰风险的残基，可以优先关注其结构位置及局部环境。
最后，结合抗原–抗体相互作用与表面性质判断优化价值。
对于位于CDR或抗原结合界面的残基，需要考虑替换后是否可能破坏原有的相互作用。
可以通过以下几个维度综合评价：
| 评价维度 | 对应分析方法 | 主要作用 |
|---|---|---|
| 残基暴露程度 | Protein Properties | 识别高度暴露的残基 |
| 化学稳定性风险 | 残基类型与局部环境分析 | 识别潜在氧化或其他修饰风险 |
| 抗原结合情况 | Protein Contacts | 判断是否参与重要的界面接触 |
| 表面疏水性质 | Protein Patches | 分析局部疏水区域 |
| 抗原表面互补性 | Protein Surface | 观察电荷及疏水性质的匹配情况 |
需要强调，以上分析主要用于筛选潜在优化位点，而不是直接确认最佳突变方案。
对于筛选出的残基，还需要进一步建立突变结构，并通过亲和力及稳定性计算评价不同替换方案。
七、进阶：静态性质计算与构象集合计算有什么区别？
本篇主要采用单个蛋白质结构进行性质计算。
但蛋白质并不是完全静止的结构，尤其是抗体的CDR环区及部分表面侧链，可能具有一定的构象柔性。
因此，基于单一结构计算得到的残基暴露程度或表面Patch面积，只能反映当前构象下的性质。
在MOE中，Protein Properties还支持基于构象集合（Ensemble）的性质计算。
这种方法可以通过采样多个蛋白质构象或质子化状态，再综合计算相关性质，从而考虑部分构象变化和环境条件的影响。
例如，抗体表面疏水Patch的面积可能随着CDR构象变化而发生改变，因此构象集合分析可能比单个静态结构更适合某些性质预测任务。
不过，构象集合计算通常需要更多计算资源，而且其结果仍然受到采样方法和评分模型的限制。
对于初步的抗体优化位点筛选，使用静态Protein Properties结合三维结构分析，已经可以提供有价值的参考信息。
八、常见问题
Q1：为什么有些残基的res_exp很高，却不一定存在开发风险？
res_exp描述的是残基的相对溶剂暴露程度。
高暴露残基并不一定具有不利的理化性质，其实际影响还取决于氨基酸类型、局部环境及蛋白质功能。
因此，不能仅根据res_exp的高低直接判断抗体是否稳定。
Q2：Protein Properties可以直接预测Met的氧化概率吗？
不能。
Protein Properties可以帮助识别Met的暴露程度及局部结构环境，但氧化反应还受到溶液条件、氧化剂暴露、蛋白质构象等因素影响。
因此，Met的实际氧化敏感性仍需要结合实验进行评价。
Q3：为什么计算Protein Properties之前需要排除抗原？
本篇的研究目标是分析抗体自身的理化性质，因此需要避免将抗原作为计算对象的一部分。
此外，结合态与游离态的蛋白质，其表面暴露情况可能不同。
如果希望评价抗体自身的聚集风险，通常应重点考虑抗体单独存在时的表面性质，而不是将抗原遮挡后的结合界面直接视为抗体的天然暴露状态。
Q4：为什么Protein Properties与Protein Patches得到的信息不同？
Protein Properties主要提供可用于比较、排序和筛选的数值性质，而Protein Patches侧重于识别和显示具有特定物理化学特征的表面区域。
两者之间并不矛盾，而是可以互相补充。
例如，Protein Patches能够帮助我们定位较大的疏水区域，而Protein Properties可以进一步提供相关的面积指标和残基性质。
九、本篇小结
本篇以CNTO607–IL-13复合物为例，介绍了MOE的Protein Properties功能，重点学习了蛋白质及残基性质计算、Residue Table排序，以及利用res_exp分析残基溶剂暴露程度的方法。
通过对Met92的分析，我们发现该残基位于CDR-L3区域，具有较高的溶剂暴露程度，并可能存在氧化相关的开发风险。结合前面教程中的Protein Contacts和Protein Surface分析，还能够进一步理解其在抗原结合界面中的局部环境。
这些结果为抗体理性突变提供了候选位点，但是否能够通过突变改善抗体性质，还需要进一步的结构与能量评价。
下一篇预告
MOE抗体的理性设计教程（06）：Protein–Protein Docking——如何预测抗原–抗体的结合模式？
下一篇将介绍MOE蛋白质–蛋白质对接的基本原理和操作流程，学习如何利用抗体CDR区域设置对接约束，并以CNTO607–IL-13为例预测和分析抗原–抗体的结合构象。
