前言
当我们RNA-seq数据来自组织样本而非单纯细胞亚群，如肿瘤组织、皮肤组织、肾脏组织甚至是血液组织等，如果有免疫细胞参与组织病变，那么可以根据目前流行分析肿瘤组织免疫浸润的方法，来分析RNA-seq转录组数据在不同样本或者组别之间对不同免疫细胞的富集差异，由此来比较不同组之间免疫细胞可能发挥的作用。
准备工作
在线免疫细胞分析网站：TIMER3（https://compbio.cn/timer3/）
数据集格式：转录数据矩阵(如下图所示1.基因名，2：对照组样本，3疾病组样本）
举例说明
步骤1:登录TIMER3网站，点击ESTIMATION界面，将转录组表达矩阵文件上传，为CSV格式，是所有基因列表，不是差异基因列表。2.选择种属。3细胞类型选择AUTO自主。4点击RUN运行。5：结果将有多种免疫浸润分析方法，并人与小鼠的不同。后续结果首推CIBERSORT分析结果进行后续分析。
步骤2：结果展示：1是富集分析表格展示，点击下载。2是提示具有多种免疫浸润分析的方法，方法名称在列名的后缀中。3-4是不同浸润方法比较不同样本之间不同免疫细胞富集情况。可以下载PDF格式进行后续编辑。
步骤3：富集结果文件格式：结果Cell＿type列中后缀为不同方法名称，后续需要将每一种方法单独拿出来分析，可在电子表格中进行：分列操作，或者直接筛选关键字进行数据整理。
步骤4：我们选择CIBERSORT结果进行后续可视化分析。现将CIBERSORT结果细胞名列复制一份，然后用替换格式，将"_CIBERSOTT"进行全部替换空格。
步骤5：由于CIBERSORT结果是相对比例，总和为1。将其数值乘以100，得到总和为100%的数据。
步骤6：利用在线绘图网站-微生信，选择柱状图，然后点击填充柱状图。
步骤7：查看数据类型。样本名为行名，其他名为列名。因此需要对上述文件进行转换。
步骤8：将文件行列名进行转换。复制到必须输入文本框中。点击提交，如2所示图形生成，点击3所在位置保存为PDF或者SVG格式。
需要提醒的是，图片只能自定义10种颜色。
步骤9：利用堆叠bar图进行输入。文本行列名不需要转换，直接复制粘贴即可。
步骤10：1输入文本，2查看颜色范围，3查看生成的图片。4点击下载。
后记：本文利用肿瘤浸润分析在线网站，以此来分析肿瘤或者非肿瘤的转录组数据所体现的组织样本的免疫细胞浸润或者免疫细胞富集情况。并通过在线绘图网站进行结果可视化绘制。
