全外显子组测序的数据质控，是个特别容易被"走过场"的环节。跑个 FastQC，看到一排绿勾，截图贴进报告，收工。我刚开始接手流程搭建的时候也是这么干的，直到有一批样本在变异检出阶段冒出一堆说不清的假阳性，回头翻质控记录才发现，那批样本的 on-target rate 只有 40% 出头，fold-80 接近 3.0，等于把一大半测序数据白扔在了目标区域外面。重新捕获来不及，整个项目延期两周。从那以后，我就把全外显子组的数据质控从一个"看一眼"的环节，改成了流程里真正会拦人的闸门。
流程走到第四步，前面实验设计、建库测序、原始数据交接这些都干完了，接下来要决定的是：这批数据到底能不能往下走、哪些样本要重做、哪些指标可以睁一只眼闭一只眼。说白了，质控这一步不产生任何科学结论，但它决定了后面所有结论的可信度。这篇讲的是我在实操里怎么设计这一环：三层指标分别看什么、每个数字背后的含义、参数为什么这么设、什么情况下必须叫停、以及那些"看着吓人其实没事"的数字怎么区分。不管你是刚接触生信流程、只会照着脚本敲命令的新手，还是手里已经有一套管线、想把质控做成自动放行的老手，应该都能从里面找到能直接抄走的东西。
1. 质控在整个WES流程里的位置与设计思路
1.1 为什么质控不是"跑个FastQC就完事"
很多人对质控的理解停留在"原始数据干净不干净"这一层，实际上 WES 的质控要分三个完全不同的层次来看，每一层对应的问题类型、工具、判断标准都不一样。
第一层是read 层面，也就是刚下机的 fastq 文件。这一层关心的是碱基质量、接头残留、N 碱基比例、GC 分布、是否有其他物种污染。工具是 FastQC、fastp、MultiQC。这一层出问题，通常是测序或者建库环节的锅。
第二层是比对层面，也就是比对到参考基因组之后的 BAM 文件。这一层关心的是比对率、重复率、插入片段长度分布、捕获效率、目标区域覆盖度和均一性。工具是 BWA-MEM、samtools、Picard/GATK、mosdepth、Qualimap。这一层出问题，可能是捕获探针批次、文库复杂度、参考基因组版本不匹配。
第三层是样本层面，也就是把所有样本放一起横向看。这一层关心的是样本间污染、性别是否和记录一致、有没有串样、批次效应。工具是 verifybamid2、SNP 指纹比对、MultiQC 汇总。这一层出问题最要命，因为它不会在单样本报告里显形，只有横向比对才看得出来。
我见过不少流程只做了第一层，FastQC 全绿就放行，结果第二层、第三层的问题一直到变异过滤阶段才暴露。所以我在自己的流程里把三层都做成强制卡点，任何一层亮红灯就中断，不允许"先跑下去看看"。
1.2 三层质控的分工与放行标准
为了让流程能自动判断，我给每个指标都定了三种状态：绿（自动放行）、黄（记录并继续，但要在报告里标注）、红（中断，等人工确认）。这个分级很关键，因为如果把所有指标都设成硬阈值，稍微偏一点就中断，流程根本跑不下去；反过来全部放行，质控就失去意义。
下面这张表是我目前用的核心指标和阈值，人类样本、双端 150bp、常规 WES 捕获芯片的场景，其他物种或者特殊建库方式要相应调整：
| 层级 | 指标 | 绿（放行） | 黄（记录） | 红（中断） |
|---|---|---|---|---|
| read | Q30 比例 | > 90% | 85%–90% | < 85% |
| read | 接头残留占比 | < 0.5% | 0.5%–2% | > 2% |
| read | N 碱基比例 | < 0.5% | 0.5%–1% | > 1% |
| read | 修剪后保留 read 比例 | > 95% | 90%–95% | < 90% |
| 比对 | 比对率 | > 98% | 95%–98% | < 95% |
| 比对 | 重复率 | < 20% | 20%–35% | > 35% |
| 比对 | on-target rate | > 70% | 55%–70% | < 55% |
| 比对 | 平均目标深度 | > 100x | 80–100x | < 80x |
| 比对 | ≥20x 覆盖比例 | > 95% | 90%–95% | < 90% |
| 比对 | fold-80 penalty | < 1.5 | 1.5–2.0 | > 2.0 |
| 样本 | 污染率 FREEMIX | < 1% | 1%–3% | > 3% |
| 样本 | 性别一致性 | 一致 | — | 不一致 |
这张表不是拍脑袋定的。Q30 90% 是 Illumina 平台近几年的常规水平，低于 85% 基本可以认为测序环节出了问题。比对率 98% 对人类样本来说不算苛刻，因为参考基因组质量好，正常样本轻松能到 99% 以上。on-target rate 和捕获芯片的设计、探针批次强相关，不同批次的芯片表现差异不小，所以我把黄色区间设得比较宽。
注意：阈值一定要跟自己的平台、芯片、建库方式绑定。别人流程里的 95% 搬到你这儿可能是灾难，因为建库方式、测序仪型号、甚至 flowcell 批次都会影响基线。我的建议是先用二十个以上已知合格的样本跑一遍，统计出自己实验室的分布，再定阈值。
1.3 工具链选型的取舍逻辑
质控工具的选择上，我踩过的坑比想象中多。这里把几个关键选择和背后的理由说清楚，省得你重复试错。
FastQC 这个没得选，它就是行业事实标准，报告模块固定、解读资料多、MultiQC 原生支持。它的问题是不做任何处理，只出报告，所以修剪还得靠别的工具。
修剪工具我在 fastp、Trimmomatic、cutadapt 之间反复横跳过。最后长期用 fastp，原因有三个：一是速度快，C++ 写的，多线程，同样数据量比 Trimmomatic 快三到五倍，这对大批量样本很关键；二是双端接头能自动识别，不需要你手动去填 adapter 序列，省掉了"接头序列填错导致修剪不干净"这类低级错误；三是单次运行同时输出 json 和 html，MultiQC 直接能读，报告链路顺。Trimmomatic 的优势是参数是 step 式的、每一步做什么非常明确，可控性强，老流程里常见，如果你想精细控制每一步的剪切逻辑，它仍然值得用。cutadapt 更适合处理非 Illumina 平台或者特殊接头。
比对工具用 BWA-MEM，这个和 GATK 的官方推荐一致。核心原因是 WES 里 indel 附近会有大量 soft-clip 的 read，BWA-MEM 对局部比对和 soft-clip 的处理更成熟，后续 indel 检出更稳。bowtie2 在短 read 场景更快，但对长 indel 的支持一般，我一般不用于 WES。
覆盖度统计这块，早期用 samtools depth，后来全换成 mosdepth。原因是 samtools depth 单线程，一个 30x 的 WES BAM 跑下来要几十分钟，mosdepth 多线程加算法优化，同样的活儿一两分钟出结果，而且原生支持 BED 区间、窗口统计、阈值量化，输出格式也规整。这个替换对整条流程的耗时改善非常明显。
汇总报告用 MultiQC，把所有样本的 FastQC、fastp、Picard、mosdepth 结果一次性拉到一个页面上，横向比对特别直观。批次效应、离群样本，往往就是在这个页面上第一眼发现的。
2. 原始下机数据的质控：从FastQC报告里读出真问题
2.1 FastQC七个关键模块到底怎么看
FastQC 一页报告十几个模块，新手容易逐条看绿勾，其实真正需要盯的就那么几个。我按重要性排一下。
Per base sequence quality是最核心的一张图。横轴是 read 上的碱基位置，纵轴是 Phred 质量值。Phred 分数 Q 和错误率的换算关系是Q = -10 × log10(P)，也就是 Q20 对应 1% 的错误率，Q30 对应 0.1%。正常的双端 150bp 数据，图形应该是前几个碱基稍微低一点（这是随机引物起始带来的偏好性，属于正常），中间平稳，末端缓慢下滑。如果末端出现断崖式下跌，说明测序后期的信号衰减明显，需要在修剪时加尾部滑窗剪切。如果整条 read 都低，那就是测序本身的问题，修剪救不回来。
Per sequence GC content值得单独说。理论上这条曲线应该是一个接近正态的单峰，峰的位置和参考基因组的 GC 含量吻合。如果出现双峰，或者整个分布明显右移，八成是污染——可能是细菌、真菌，也可能是另一个物种的样本串进来了。这时候不要急着往下跑，先做物种溯源。
Sequence Duplication Levels里蓝线是理论分布、红线是实际分布。WES 因为要经过 PCR 扩增，重复率天然比 PCR-free 的 WGS 高，15%–25% 很常见，不用紧张。真正要警惕的是红线远远跑到蓝线右边，重复率超过 40%，那说明文库复杂度太低，可能是起始 DNA 量不够、PCR 循环数过多，这种样本即使测了，有效信息量也有限。
Overrepresented sequences列出占比超过 0.1% 的序列。这里出现接头序列、引物序列、rRNA 片段都很正常，但如果出现一段你完全陌生的序列且占比很高，就要警惕外源污染。
Per base N content一般应该贴着底部，超过 1% 说明测序仪在某个位置读不出来，通常是硬件或者试剂问题。
Adapter Content是累积曲线，理想状态是全贴底。这条曲线一旦抬头，就必须修剪，否则接头序列会被当成 read 比对到参考基因组上，制造假阳性变异。
Per tile sequence quality是按 flowcell 的 tile 分块看质量。如果某一块区域整片泛红，说明那个位置的测序出了问题，通常是气泡、堵塞或者试剂分布不均。这类问题属于硬件层面，你没法处理，但必须在报告里记录下来，作为后续判断依据。
2.2 接头污染与低质量碱基的处理策略
接头污染的来源主要有两个：一是插入片段长度小于测序读长，导致 read 末端读进了接头序列；二是接头二聚体。前者在插入片段分布偏短的文库（比如 FFPE 样本、降解样本）里特别常见。
处理思路要分情况。如果只是零星的接头残留，fastp 的自动检测加默认修剪就够了。如果 Adapter Content 曲线抬头很明显，或者插入片段整体偏短，就需要打开滑窗质量剪切，把末端低质量区一并切掉。
这里有个很实际的取舍：修剪得越狠，数据越干净，但有效 read 也越少。我在实际操作中会看"修剪后保留 read 比例"这个指标，如果低于 90%，就要回头想想是不是参数设得过严，而不是无脑加码。有些同行为了追求 FastQC 全绿，把参数调得极狠，结果丢了 20% 的数据，得不偿失。
还有一个容易忽略的点：双端 read 的重叠区纠错。fastp 默认会对双端 read 的重叠区域做一致性校正，把低质量的碱基用高质量的互补碱基覆盖掉。这个功能对降低整体错误率有帮助，但对 WES 来说，重叠区的校正会轻微改变碱基质量值的分布，如果你后续要做严格的 BQSR，需要留意一下。我的做法是默认开启，因为这个校正带来的收益通常大于那点分布扰动。
2.3 fastp的完整参数配置与逐项解释
下面这套是我目前稳定在用的配置，人类双端 150bp WES 场景，可以直接抄：
fastp \ -i raw_R1.fastq.gz -I raw_R2.fastq.gz \ -o clean_R1.fastq.gz -O clean_R2.fastq.gz \ --detect_adapter_for_pe \ --cut_front --cut_tail \ --cut_window_size 4 --cut_mean_quality 20 \ -q 20 -u 30 -n 5 -l 50 \ --correction \ --thread 16 \ --json qc/sample.json --html qc/sample.html \ --report_title sample_fastp_report逐个拆一下为什么这么设。
--detect_adapter_for_pe是双端接头自动检测。虽然 fastp 内置了 Illumina 常见接头序列，但不同建库试剂盒的接头序列可能有细微差别，自动检测比死填序列稳。这个参数一定要开，尤其是你不确定建库试剂盒型号的时候。
--cut_front --cut_tail --cut_window_size 4 --cut_mean_quality 20这一组是滑窗质量剪切。逻辑是从 read 两端各取一个 4bp 的窗口，如果窗口内平均质量低于 Q20，就把这个窗口切掉，然后往前推进。开启cut_front是为了处理 read 开头那几个碱基的随机引物偏好性带来的低质量，cut_tail处理末端衰减。窗口设 4 而不是更大，是因为窗口越大越容易误伤，4bp 的颗粒度对 150bp 的 read 比较合适。
-q 20定义"合格碱基"的门槛，-u 30表示一条 read 里不合格碱基超过 30% 就整条丢弃。这两个配合使用。为什么不用更严的 Q30？因为 Q30 作为丢弃阈值太狠了，会丢掉大量只是末端稍微差一点的 read，而 Q20 对应的 1% 错误率已经能满足 WES 变异检出的需求。
-n 5表示 N 碱基超过 5 个就丢弃。-l 50表示修剪后长度短于 50bp 的 read 直接丢弃。这个 50 是经验值，正常 WES 插入片段在 150–250bp，修剪后还能留 100bp 以上，所以 50 基本不会误伤。但如果你做的是 FFPE 或者降解严重的样本，插入片段本身就短，这时候要降到 30，否则会丢掉大量有效 read。我吃过这个亏，一批 FFPE 样本用了-l 50，直接丢了快两成数据。
--correction开启重叠区纠错。前面说了，默认开。
--thread 16线程数，按机器核数调，一般设到物理核数就行，设太高反而因为内存带宽成为瓶颈。
还有两个参数我特意没用：--dedup和--trim_poly_g。--dedup是 fastp 自带的序列级去重，它会直接丢掉重复的 read 对。这个做法我强烈不推荐，原因在下一章展开。--trim_poly_g是修剪 polyG 尾巴，这是 NextSeq/NovaSeq 双色荧光平台的特有现象，如果你用的是这类平台，需要加上；如果是四色平台的旧机型，就不用。
提示：修剪完一定要重新跑 FastQC，和修剪前的报告并排放，确认接头曲线下去了、末端质量抬上来了。我见过有人改完参数没复检，等于白改。
3. 比对层面的质控：比对率、重复率、捕获效率
3.1 BWA-MEM比对与read group的坑
比对这一步，重点不是"跑通"，而是"跑对"。BWA-MEM 本身的参数不多，但 read group 这个事必须说透。
bwa mem -t 16 -K 100000000 \ -R '@RG\tID:sample01\tSM:sample01\tPL:ILLUMINA\tLB:lib01\tPU:unit01' \ ref.fa clean_R1.fastq.gz clean_R2.fastq.gz \ | samtools sort -@ 8 -m 2G -o sample01.sorted.bam - samtools index sample01.sorted.bam-R里的SM字段是样本名，ID是 read group 标识，LB是文库名，PL是测序平台。这几个字段里，SM最关键，因为 GATK 后续会按SM把 read 分组，判断哪些 read 属于同一个样本。如果SM写错了，会出现两种典型灾难：一是同一个样本的多个文库被当成不同样本，导致变异检出时把它当混合样本处理；二是不同样本的SM被写成一样，导致所有样本被合并，最后出的 VCF 只有一条样本记录。
这个坑我在早期项目里踩过一次，当时是批量脚本里的变量替换出了错，几百个样本的SM全成了一个值。表面上看流程跑得顺顺利利，直到变异检出的 VCF 打开只有一列样本才发现不对，全部重跑。
-K参数控制每次批处理加载到内存的碱基数，默认是 1000 万。这个值会影响内存占用和比对的批次划分，设大了内存吃得凶，设小了批次多、速度稍慢。我一般设成 1 亿，配合足够的线程数，速度比较理想。
-t 16是线程数。这里有个实操建议：BWA-MEM 的线程效率不是线性的，超过 16 线程后提升不明显，而 samtools sort 是另一个瓶颈。我的做法是 BWA 用 16 线程，管道后接 samtools sort 用 8 线程、2G 内存缓冲，整体吞吐比较平衡。
3.2 重复率的正确解读与去重时机
重复率这个指标特别容易被误读。先说清楚它是怎么来的。
WES 的重复 reads 有两个来源：一是 PCR 扩增偏倚，同一个原始 DNA 分子被扩增了多份，测出来是同一条序列；二是测序深度足够高时，随机取样的碰撞。对于 100x 以上的深度，第二种来源占比不低，这部分重复是数学上不可避免的，不代表文库质量差。
所以看到一个 25% 的重复率，不要慌。判断标准要看同批次比较：如果同批次样本普遍在 15%–20%，某个样本突然 40%，那说明这个样本的文库复杂度确实低，值得回头看建库记录。如果全批次都是 35%，那更可能是芯片/测序深度/建库方式带来的系统性特征，不是单样本问题。
去重的工具我用 GATK 的 MarkDuplicates（底层就是 Picard）：
gatk MarkDuplicates \ -I sample01.sorted.bam \ -O sample01.md.bam \ -M qc/sample01.md_metrics.txt \ --CREATE_INDEX true \ --VALIDATION_STRINGENCY LENIENT注意这里是Mark（标记）而不是Remove（移除）。标记的意思是给重复 read 打上 flag，但不从 BAM 里删掉。为什么不删？因为后续的变异检出环节需要这些重复 read 来提供支持证据，尤其是低等位频率的位点。GATK 的 HaplotypeCaller 默认会忽略标记为重复的 read，但保留它们在文件里，便于回溯和可视化检查。直接删掉就失去了这层信息。
去重的时机也很关键。标准顺序是：比对 → 排序 → 标记重复 → BQSR（碱基质量值重校准）→ 变异检出。去重必须在 BQSR 之前，因为重复 read 会让同一个位置的碱基被重复计数，干扰质量值的经验估计。这个顺序如果搞反了，BQSR 的校正结果会有系统性偏差，虽然不一定报错，但会影响后续的变异质量。
还有一个常见误区：试图在 fastq 层面用 fastp 的--dedup去重。这个做法的问题是，fastp 只能基于序列完全一致来判断重复，而真正的重复判断要基于比对坐标——两条序列不完全一样但比对到同一个起始位置的 read，才是真正的 PCR 重复。所以 fastq 层去重会漏掉大量真重复，同时误删一些序列相同但实际来自不同基因组位置的 read（比如重复区域）。我的做法是 fastq 层完全不去重，全部交给 BAM 层的 MarkDuplicates。
3.3 捕获效率与覆盖度的计算实操
WES 和 WGS 最大的区别就在这一步：你花钱测的是全基因组，但真正有用的只是那 1%–2% 的编码区。所以"捕获效率"（on-target rate）直接决定了这笔钱花得值不值。
计算 on-target rate 最直接的方式是用 GATK 的 CalculateHsMetrics：
gatk CalculateHsMetrics \ -I sample01.md.bam \ -O qc/sample01.hs_metrics.txt \ -R ref.fa \ --BAIT_INTERVALS bait.interval_list \ --TARGET_INTERVALS target.interval_list \ --PER_TARGET_COVERAGE qc/sample01.per_target_coverage.txt这里要区分两个概念：bait是探针覆盖的区域，target是你真正关心的区域。探针设计时 bait 通常比 target 略大，因为要留出捕获的余量。计算 on-target rate 用的是 bait，计算覆盖度用的是 target。把这两个搞混是新手常见错误，会导致指标口径不一致，不同批次没法横向比。
输出文件里有几个关键字段值得重点看：
| 字段 | 含义 | 参考范围 |
|---|---|---|
PCT_SELECTED_BASES | on-target rate | > 0.70 |
MEAN_TARGET_COVERAGE | 目标区平均深度 | > 100 |
PCT_TARGET_BASES_20X | ≥20x 覆盖的靶碱基比例 | > 0.95 |
FOLD_80_BASE_PENALTY | 覆盖均一性 | < 1.5 |
PCT_PF_READS_ALIGNED | 比对率 | > 0.98 |
AT_DROPOUT/GC_DROPOUT | AT/GC 偏好导致的覆盖缺失 | 越低越好 |
ZERO_CVG_TARGETS_PCT | 完全无覆盖的靶区比例 | < 0.02 |
FOLD_80_BASE_PENALTY这个指标值得单独解释，因为它最容易被忽略但信息量最大。它的计算方式是：把所有靶碱基按覆盖深度排序，取第 20 百分位的深度值，用平均深度除以这个值。理想情况是 1.0，意思是 80% 的靶区域深度都达到了平均值。如果算出来是 2.5，意味着 80% 的区域深度只达到平均值的 40%，覆盖严重不均——少数区域深度极高，大量区域深度很低。这种样本即使平均深度看着漂亮（比如 150x），实际有效覆盖可能很差。
AT_DROPOUT和GC_DROPOUT反映的是捕获探针的序列偏好。GC 含量极高的区域（比如启动子区、第一外显子）捕获效率天然低，这是技术限制。如果这两个值异常高，说明该样本在高 GC 或高 AT 区域的覆盖缺失明显，后续做 CNV 分析时要特别小心。
除了 CalculateHsMetrics，我还会用 mosdepth 做一次交叉验证，因为它速度更快，而且能输出窗口级的深度分布，便于画图：
mosdepth \ -t 8 \ -b target.bed \ -n \ --by 200 \ --quantize 0:1:10:20:30:50:100: \ qc/sample01 \ sample01.md.bam--by 200表示按 200bp 窗口统计，--quantize定义了深度分档，输出文件里会直接给出每一档覆盖的碱基比例。-n表示不输出 per-base 文件（那个文件几十 GB，一般不需要）。跑完会得到sample01.mosdepth.summary.txt和几个 regions 文件，summary 里有总平均深度、各染色体的平均深度，regions 文件里是每个窗口的深度。
如果你想自己算一份定制化的报告，用 mosdepth 的窗口输出配合一段 Python 就够了：
import gzip def coverage_summary(regions_gz, thresholds=(1, 10, 20, 30, 50)): depths = [] with gzip.open(regions_gz, 'rt') as fh: for line in fh: parts = line.rstrip('\n').split('\t') depths.append(float(parts[-1])) n = len(depths) mean = sum(depths) / n res = {'windows': n, 'mean_depth': round(mean, 2)} for t in thresholds: hit = sum(1 for d in depths if d >= t) res[f'pct_ge_{t}x'] = round(hit / n * 100, 2) ordered = sorted(depths) p20 = ordered[int(n * 0.2)] res['fold80'] = round(mean / p20, 2) if p20 > 0 else None return res print(coverage_summary('qc/sample01.regions.bed.gz'))这段脚本按窗口算，不是按碱基算，所以算出来的百分比和 CalculateHsMetrics 会有一点差异，但趋势一致，用来做快速筛查足够了。如果要严格按碱基算，得读 per-base 文件，那个开销大得多，我一般只在对某个样本有疑问的时候才做。
注意：用
samtools depth算平均深度有一个经典陷阱。不加-a参数时，它只输出有 read 覆盖的位置，没覆盖的位置压根不出现在结果里。这时候你拿总深度除以行数，算出来的平均值会系统性偏高，因为零覆盖的位置被排除了。必须加-a把零覆盖位置也输出，或者干脆换 mosdepth。我第一次踩这个坑的时候，一个实际只有 60x 的样本算出来是 95x，白高兴一场。
4. 样本层面的质控：污染、性别与一致性
4.1 污染率估算：看不见的杀手
样本间污染是质控里最隐蔽的问题，因为它不会让任何单个指标明显异常，但会系统性地污染下游所有变异检出结果。轻度污染的样本，低等位频率的假阳性会明显增多；重度污染的样本，基因型判断直接失真，纯合会被判成杂合。
估算污染我用 verifybamid2，它基于一组公共的常见 SNP 位点，通过比对 read 上的等位基因频率分布来反推污染比例：
verifybamid2 \ --Reference ref.fa \ --BamFile sample01.md.bam \ --SVDPrefix 1000g.phase3.100k.b38.vcf.gz.dat \ --Output qc/sample01.selfSM \ --Verbose \ --NumThread 8输出文件里的FREEMIX就是污染率估计值。我的判断标准是：低于 1% 视为干净，1%–3% 要记录并在报告里标注，超过 3% 就要考虑样本降级或者重抽。超过 5% 基本可以判定污染，这个样本的变异检出结果不能直接用于临床或科研结论。
CHIPMIX是另一个字段，用来估计是否存在同一个体的另一种组织混入（比如血液样本里混了口腔上皮）。这个值异常的情况比较少见，但如果出现，值得回头查样本采集记录。
这里要说清楚一点：verifybamid2 需要一份参考的 SNP 位点集合和对应的 SVD 模型文件，这些属于公开资源，具体来源按你所在环境的规范获取，不要随便网上下一个来源不明的文件。模型文件和参考基因组的版本必须严格对应，版本不一致算出来的污染率会是错的。
4.2 性别核查与样本指纹比对
性别核查是个成本极低但价值极高的检查。原理很简单：男性只有一条 X 染色体，Y 染色体有覆盖；女性有两条 X 染色体，X 上的杂合位点比例接近正常常染色体，Y 染色体基本无覆盖。
实操上有两种做法。一种是看覆盖度：统计 X 和 Y 染色体的平均深度，除以常染色体的平均深度做归一化。正常男性 X 的相对深度约 0.5，Y 约 0.5；正常女性 X 约 1.0，Y 接近 0。这个方法快，但对覆盖度不均一的样本会有波动。
另一种是看杂合度：统计 X 染色体非拟常染色体区域上的杂合 SNP 比例。女性应该在 0.3%–0.5% 这个量级，男性接近 0。这个方法更准，但需要先跑一遍变异检出。
我一般两个都做，交叉验证。如果两个结果都指向同一个性别，但和登记记录不符，那就是样本错配，必须整批回溯。
样本指纹比对是另一个必做项，尤其在多样本同批上机的情况下。做法是挑一组高多态性的 SNP 位点，从每个样本的 BAM 里提取基因型，两两计算一致性。同批次内，除了已知的重复样本，其他样本之间的一致性应该在 50%–60% 左右（随机两个无关个体的一致性就在这个量级）。如果两个样本的一致性超过 90%，那基本可以确定是同一个样本被测了两次，或者发生了串样。
这一步的价值在于：它能发现前两层质控完全看不出来的问题。两个样本各自的数据都很漂亮，FastQC 全绿、比对率 99%、覆盖度 120x，但它们其实是同一个人的 DNA——这种问题只有横向比对才能发现。
4.3 质控汇总：把散落的指标收成一张表
单样本的报告再详细，也没法替代横向汇总。我的做法是每个样本跑完质控后，把关键指标写进一个统一的 TSV，最后用 MultiQC 或者自建的脚本做可视化。
字段大致是这样：
import pandas as pd fields = [ 'sample_id', 'raw_reads', 'clean_reads', 'clean_ratio', 'q30_before', 'q30_after', 'adapter_pct', 'mapping_rate', 'dup_rate', 'insert_size_median', 'on_target_rate', 'mean_depth', 'pct_20x', 'pct_30x', 'fold80', 'gc_dropout', 'at_dropout', 'freemix', 'sex_check', 'fingerprint_cluster' ] df = pd.DataFrame(columns=fields) df.to_csv('qc/batch_summary.tsv', sep='\t', index=False)这张表的作用是让离群样本无处遁形。我会按mean_depth和fold80画散点图，正常样本会聚成一团，离群的点一眼就能看出来。也会按on_target_rate排序，看看有没有明显低于批次中位数的。
这里有个经验：批次效应比单样本异常更常见，也更容易被忽略。如果某一批样本的 on-target rate 集体比上一批低 10 个百分点，那大概率是捕获探针批次或者实验操作的问题，而不是每个样本各自出了状况。这种情况下，单看每个样本的报告都是"黄灯但不严重"，横向一看才知道是系统性问题。所以汇总这一步不是可选项，是必做项。
提示：把历史批次的汇总表也留着，做成累积视图。新批次进来的时候和过去半年的数据比一比，能提前发现试剂批次、操作人员、设备状态的变化。这个习惯帮我躲过好几次批量返工。
5. 常见问题排查与踩坑实录
5.1 问题速查表
下面这张表是我这些年攒下来的，基本覆盖了 WES 质控里八成以上的异常情况：
| 现象 | 可能原因 | 排查动作 | 处理方式 |
|---|---|---|---|
| Adapter Content 曲线抬头 | 插入片段短于读长、接头二聚体 | 看插入片段分布、Overrepresented sequences | 开启自动接头检测 + 尾部剪切；必要时缩短-l |
| Per sequence GC 双峰 | 外源物种污染、样本串入 | 抽样比对统计物种分布、看比对率 | 确认污染源，样本降级或重测 |
| Q30 低于 85% | 测序试剂问题、flowcell 老化 | 看 Per tile 图定位区域 | 联系测序方核查，考虑重测 |
| 比对率低于 95% | 参考基因组版本错、接头未去净、污染 | 核对参考版本、复检接头、抽 read 看比对情况 | 修正参考版本重跑；补修剪 |
| 重复率超过 35% | 文库复杂度低、起始量不足、PCR 循环过多 | 查建库记录、同批次横向比 | 标记去重后评估有效深度，必要时重测 |
| on-target rate 低于 55% | 捕获失败、探针批次问题 | 查捕获实验记录、对照同批次 | 重新捕获，不要硬跑 |
| fold-80 超过 2.0 | GC 偏好、捕获不均 | 看 GC_DROPOUT、画深度分布图 | 记录并在下游用 callable loci 过滤 |
| 目标区平均深度不足 | 数据量不够、捕获效率低 | 算理论数据量需求 | 补测数据；或降低检出灵敏度预期 |
| FREEMIX 超过 3% | 样本交叉污染 | 查样本处理记录、做 SNP 指纹 | 重抽样本，整批回溯操作流程 |
| 性别与记录不符 | 样本错配、标签贴错 | SNP 指纹两两比对 | 整批回溯，重新采样 |
| 两样本指纹一致性 > 90% | 同一份样本重复上机、串样 | 核对样本编号、查实验记录 | 剔除重复样本，重新计算批次 |
5.2 几个印象深刻的坑
第一个坑是"平均深度够了但覆盖不够"。有一批样本平均深度都在 130x 以上，看着很漂亮，但做变异检出的时候，某些样本的检出位点数明显偏少。回头算PCT_TARGET_BASES_20X，发现有几个样本只有 88%，比批次中位数低了 8 个百分点。原因就是 fold-80 偏高，深度分布极度不均——少数区域被过度测序，大量区域深度不足。这说明"平均深度"这个指标有欺骗性，必须配合覆盖比例和均一性一起看。后来我在流程里加了一条规则：PCT_TARGET_BASES_20X低于 92% 就自动标黄，必须在报告里说明。
第二个坑是插入片段的长度阈值。前面提过，-l 50在 FFPE 样本上丢了近两成数据。那次之后我改成按样本类型动态配置：新鲜组织/血液样本用 50，FFPE 或降解样本用 30，同时看 fastp 报告里的插入片段峰值，峰值低于 120bp 就自动切到宽松模式。这个改动看起来不起眼，但对降解样本的数据利用率提升非常明显。
第三个坑是 downsample 的必要性。同一个项目里，有的样本测了 12Gb，有的测了 8Gb，深度差了 50%。这种情况下，深度高的样本在变异检出时会有系统性优势，导致样本间比较失真。我的做法是在 BAM 层面做 downsample，把所有样本统一到相同的有效深度：
gatk DownsampleSam \ -I sample01.md.bam \ -O sample01.ds.bam \ -P 0.75 \ --RANDOM_SEED 42 \ --CREATE_INDEX true-P是保留比例，按目标深度除以当前深度算。--RANDOM_SEED一定要固定，否则每次跑结果不一样，没法复现。这个操作在多样本联合分析（比如 CNV、群体频率比较）里尤其重要。
第四个坑是不要用 FastQC 的"PASS/FAIL"直接做流程判断。FastQC 的判定逻辑很粗，某些模块对 WES 数据天然就是 FAIL，比如 Sequence Duplication Levels 和 Per base sequence content 的前几位，这些 FAIL 完全正常，不影响后续分析。如果流程按 FastQC 的 fail 数量来判断放行，会导致大量合格样本被拦下。我的做法是忽略 FastQC 的判定，只读原始数值，用自己定义的阈值判断。
第五个坑是质控报告的可追溯性。早期我没存中间文件，只留了最终报告。后来有一次要复查半年前的一个样本，发现当时用的 fastp 版本和参数都没记录，只能凭记忆推断。现在我的做法是每次运行都把完整命令行、软件版本、参考基因组 md5 写进一个 log 文件，和报告一起归档。这个习惯在复现问题和应对审计时价值极高。
最后分享一个我一直在用的判断原则：质控的目的不是让所有指标都变成绿色，而是知道每个偏离正常值的数字意味着什么风险。有些偏离可以接受，有些必须叫停，区别在于这个偏离会不会影响下游结论的可靠性。搞不清这一点，质控就会变成一种仪式，看着很规范，实际上什么都没防住。
