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微生物群移植中的微生物组错配会导致持续的脱靶代谢及免疫调节效应

研究论文

● 原文:Cell(IF 42.5 )

●原文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(25)00564-1

● DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.05.014 （2025/6/6）

● 第一作者：Orlando DeLeon，Mora Mocanu

● 通讯作者：Eugene B. Chang（echang@bsd.uchicago.edu），Kristina Martinez-Guryn（kmarti2@midwestern.edu）

● 主要单位：芝加哥大学医学系、中西部大学生物医学科学系

亮点

● 微生物通过改变局部肠道环境来增强自身适应性和定植能力；

● 不匹配的菌群会改变宿主组织及局部微生物组的代谢和免疫状态；

● 粪菌移植（厌氧性）微生物在小肠中的定植具有持久性；

● 小肠和大肠中区域匹配的微生物群可恢复（肠道）稳态。

摘要

粪菌移植（FMT）是一种应用日益广泛的干预手段，但其恢复肠道区域微生物群（尤其是小肠内微生物群）的适用性仍存疑问，原因在于其菌群以厌氧菌为主。在通过上消化道内镜接受粪菌移植的人类受试者中，4周后观察到厌氧菌在十二指肠定植。我们推测，经口粪菌移植会造成宿主-微生物错配，进而影响小肠稳态。为验证这一假设，我们对经抗生素处理的无特定病原体（SPF）小鼠分别给予空肠、盲肠或粪便来源的微生物群移植（分别简称JMT、CMT、FMT），并在1个月或3个月后进行研究。结果显示，空肠菌群移植和粪菌移植会改变区域微生物群的组成与功能、能量平衡，以及肠道和肝脏的转录组；其中，空肠菌群移植更倾向于影响宿主代谢通路，而粪菌移植则更易作用于免疫通路。菌群移植会调控肠道区域特性相关分子（Gata4、Gata6和Satb2）及下游分化标志物的表达。通过对暴露于代谢物的人类肠类器官，以及粪菌移植后的十二指肠活检样本进行RNA测序（RNA-seq），验证了小鼠模型中的转录变化。因此，粪菌移植后的区域微生物群错配可能导致非预期后果，提示有必要重新审视基于微生物组的干预策略。

结果

小肠和大肠的菌群移植可在肠道内定植，并改变原生的区域微生物群落

我们对7名通过上消化道内镜接受粪菌移植（FMT）的受试者进行了研究，对粪菌移植前及移植后1个月的样本进行了16S rRNA扩增子测序（图 1A）。尽管在β多样性方面未发现显著差异（图 1B；未加权UniFrac距离，PERMANOVA 检验，p =无统计学意义），但我们检测到粪菌移植后严格厌氧菌数量增加（图 1C；配对t检验，∗p < 0.05），这证实了小肠内厌氧菌群定植显著增加的报道。

由于小肠菌群（SBM）和大肠菌群（LBM）存在差异，我们推测小肠内厌氧菌的定植可能对宿主产生不良影响。鉴于在人类中研究这一问题存在难度，我们采用了抗生素处理后的不同菌群移植（MT）模型，以更好地阐明区域菌群错配所带来的后果。我们对来自杰克逊实验室（JAX）的C57Bl6小鼠进行了为期2周的抗生素（ABX；氨苄西林、万古霉素、新霉素和甲硝唑）处理，随后通过口服灌胃方式给它们单次移植以下菌群：小肠菌群（空肠菌群，即JMT [空肠菌群移植]）、大肠菌群（结肠菌群，即FMT [粪菌移植]）、小肠与大肠混合菌群（盲肠菌群，即CMT [盲肠菌群移植]），或不进行菌群移植（仅磷酸盐缓冲液[PBS]），移植所用菌群来自室内繁殖的供体小鼠（图 1D）。盲肠菌群移植（CMT）和粪菌移植（FMT）的接种物按1:10稀释，以适应大肠中较高的菌落形成单位（CFUs）。首先，我们通过16S rRNA测序分析了各肠道区域生态系统内的菌群，以确定菌群移植是否改变了菌群组成。在处死小鼠时，直接从各肠道区域采集肠腔内容物，这些内容物代表了特定于大肠和小肠的菌群群落。对整个肠道的β多样性比较（图 1E 和 1F）显示，菌群组成因移植类型和肠道区域（小肠 vs. 大肠）而存在差异，这表明菌群本身的差异及其所处的生态系统共同决定了区域菌群组成（未加权UniFrac距离，PERMANOVA检验，p < 0.05，所有成对比较）。对各肠道区域的分析显示，每个肠道区段都有独特的菌群组成（图 S1A-S1D），且α多样性的变化具有移植依赖性（图 S1E-S1H）。

接下来，我们通过计算每种菌群移植（MT）所特有的扩增子序列变体（ASVs）的占比，评估了移植微生物的定植情况。众所周知，不同动物设施中的菌群存在显著差异，每个小鼠群体都含有独特的微生物菌株。对ASV重叠情况的评估显示，杰克逊实验室（JAX）与我们设施的小鼠菌群中，共同的ASV占比≤5%。明确的供体菌株在最终菌群群落的ASVs中占5%–35%（图 1G）。不出所料，空肠菌群移植（JMT）的微生物在空肠中的定植率为20%，而在盲肠和结肠中的定植效率较低（15%）。粪菌移植（FMT）和盲肠菌群移植（CMT）的微生物在盲肠和结肠这两种厌氧环境中的定植效果最佳，定植率为28%–30%，在需氧的空肠中定植率较低（5%–10%）。这与空肠菌群移植后需氧菌水平较高、粪菌移植后厌氧菌水平较高的结果一致（图 1H 和 1I）。其中包括空肠菌群移植小鼠体内的需氧菌属——乳杆菌属（Lactobacillus），以及粪菌移植小鼠体内的厌氧菌属——ileibacterium属、Dubosiella属、Faecalibaculum属、Enterorhabdus属和脱硫弧菌属（Desulfovibrio）（图 1J）。特定肠道区域中，部分细菌科完全缺失，这表明菌群移植对区域菌群的恢复（或无法恢复）具有显著影响（图 1K）。我们还统计了在受体小鼠中检测到的、来自供体移植材料的独特且非冗余的ASV数量。在供体移植材料中，共鉴定出449个非冗余ASV。在所有实验中，空肠菌群移植的供体材料中检测到109个ASV，粪菌移植的供体材料中检测到217个，盲肠菌群移植的供体材料中检测到422个。在这些ASV中，空肠菌群移植受体小鼠中平均检测到18.27个（标准差=±10.64），盲肠菌群移植受体小鼠中平均检测到34.42个（标准差=±18.12），粪菌移植受体小鼠中平均检测到27.97个（标准差=±14.32）。各区域中特定ASV的定植情况详见图 S2，供体ASV在受体小鼠中的平均定植率为10%–30%（图 S2B 和 S2C）。在长达3个月的时间里，我们仍观察到定植现象以及因移植类型不同而产生的菌群组成差异，这凸显了单次移植的微生物具有持久性定植的特点（见数据 S1）。

为了分析菌群移植后最终菌群群落的功能潜力变化，我们对这些小鼠的结肠内容物进行了宏基因组鸟枪法测序，并进行了KEGG直系同源物（KO）通路分析，比较了特定移植组相对于磷酸盐缓冲液（PBS）对照组中富集的通路（图 S3）。通路分析显示，盲肠菌群移植和粪菌移植后恢复的通路数量（分别为95条和79条）多于空肠菌群移植（45条），其中许多通路在所有移植组中均有共享，但也有部分通路具有特异性（图 S3B 和 S3C）。有趣的是，空肠菌群移植的宏基因组中，脂肪酸生物合成通路尤其富集，而β-氧化基因、胆盐水解酶和7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-HSDHs）的含量较低（图 S3D–S3K；方差分析，∗p < 0.05）。

综上所述，这些数据表明，单次小肠菌群（SBM）和大肠菌群（LBM）移植能够成功定植于整个肠道（不仅是它们的原生生态位），并且可以改变区域微生物组成和功能潜力，且这种定植具有持久性。这进一步印证了在人类粪菌移植（FMT）后，小肠内厌氧菌定植增加且具有持久性的类似观察结果。

图1. 小肠和大肠的菌群移植可在肠道内定植，并改变原生的区域微生物群落

（A）人类粪菌移植（FMT）中的样本采集。

（B）菌群移植后1个月肠道内容物的16S rRNA测序结果。基于未加权UniFrac距离的β多样性主坐标分析（PCoA）（粪菌移植前，蓝色；粪菌移植后，红色；PERMANOVA检验，无显著差异；p > 0.05）。

（C）粪菌移植前后严格厌氧菌的占比（配对t检验，∗p < 0.05）。

（D）小鼠抗生素处理后移植模型的实验设计。

（E和F）菌群移植后1个月肠道内容物的16S rRNA测序结果。（E）基于未加权UniFrac距离的所有样本β多样性主坐标分析（按移植类型着色：磷酸盐缓冲液[PBS]，灰色；空肠菌群移植[JMT]，粉色；盲肠菌群移植[CMT]，橙色；粪菌移植[FMT]，淡紫色）；（F）按肠道区域着色（小肠，红色；大肠，蓝色；PERMANOVA 检验，∗p < 0.001）。

（G）在空肠、回肠、盲肠和结肠中，每种移植类型中源自供体的扩增子序列变体（ASVs）占比（即菌群移植定植率，方差分析，∗p < 0.05）。

（H和I）基于16S rRNA测序的需氧菌兼性厌氧菌占比及厌氧菌占比（方差分析，Tukey事后检验，∗p < 0.05）。

（J）各肠道区域中空肠菌群移植（JMT）与粪菌移植（FMT）之间丰度存在差异的属。图中显示了Maaslin2软件生成的显著富集系数（JMT富集的属为粉色，FMT富集的属为淡紫色）。

（K）不同处理组和肠道区域中排名前50的属的热图（采用log2 scale）。

本图缩写包括：DJ，十二指肠-空肠；JE，空肠；IL，回肠；CE，盲肠；CO，结肠。所有误差线均表示±标准差（SD）。

小肠和大肠菌群移植改变区域和全身代谢物库

代谢物浓度的区域差异在一定程度上是由特定区域的微生物转化作用所驱动的。这些代谢物可作为信号分子影响宿主健康。为了表征微生物组的功能输出，我们对十二指肠-空肠和结肠肠腔内容物进行了靶向代谢组学分析。

我们检测了300多种已知的人类及微生物产生或修饰的化合物，涵盖胆汁酸（BAs）、短链脂肪酸（SCFAs）、氨基酸以及碳水化合物/糖类等。在十二指肠-空肠或结肠中，空肠菌群移植（JMT）组与粪菌移植（FMT）组之间有70种化合物的丰度存在差异（分别如图2A和2B所示；方差分析，校正后p值<0.05）。通过主成分分析（PCA）可视化空肠菌群移植组与粪菌移植组的区域代谢组差异，突出显示了菌群移植类型对微生物组功能输出的影响（图2C-2E；PERMANOVA检验，空肠菌群移植组vs.粪菌移植组，p < 0.05）。磷酸盐缓冲液（PBS）组和粪菌移植组的代谢组学特征相似。在粪菌移植组的十二指肠-空肠中，我们检测到丙酸水平较高；纤维二糖等复杂碳水化合物以及蔗糖、葡萄糖、果糖等单糖水平较低；甘露醇、麦芽糖醇、山梨糖醇和卫矛醇等糖醇水平也较低。与空肠菌群移植组相比，粪菌移植组的结肠中糖类/糖醇以及亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺和赖氨酸等氨基酸的水平较低。我们观察到胆汁酸库存在显著差异，包括牛磺鹅脱氧胆酸（tauroCDCA）、牛磺胆酸（tauroCA）和甘胆酸（glycoCA）等结合型胆汁酸水平较低。空肠菌群移植使十二指肠-空肠中胆汁酸的总浓度升高（图2F；方差分析，p < 0.05），使结肠中次级胆汁酸的比例降低（图2G；方差分析，p < 0.05），结合型胆汁酸比例有升高趋势但未达统计学显著性（图2H；方差分析，p > 0.05）。

我们发现，菌群移植（MTs）还会影响血浆中的全身循环代谢物库，通过主成分分析（PCA）和热图可观察到空肠菌群移植（JMT）组与粪菌移植（FMT）组之间存在明显差异（图2J和2I；PERMANOVA检验，JMT组vs.FMT组，p < 0.05）。JMT组血浆中的碳水化合物以及天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸等氨基酸含量更高，而FMT组的异亮氨酸含量更高（图2I；方差分析，p < 0.05）。然而，与JMT组相比，FMT组血浆中循环的棕榈酸、肉豆蔻酸、亚油酸和顺式油酸等脂肪酸浓度更高。这与循环胆汁酸库的变化相关（图2K-2M）。接受JMT处理的动物血浆总胆汁酸浓度显著升高（方差分析，p < 0.05），且检测到结合型胆汁酸增加。这些差异是由JMT组小鼠体内β-鼠胆酸和胆酸（CA）的富集引起的，代谢组的持续性变化长达3个月，其特征表现为氨基酸、胆汁酸和碳水化合物浓度发生类似变化（见数据S1）。综上所述，这些数据表明，小肠菌群（SBM）和大肠菌群（LBM）不仅会影响肠道区域微生物群的组成和功能输出，还会影响多种经微生物修饰和产生的代谢物类别。

图2.小肠和大肠菌群移植会改变区域及全身的代谢物库

（A和B）靶向代谢组学分析中十二指肠-空肠和结肠内差异丰度代谢物的热图。对于任意两组间存在显著差异的代谢物（方差分析，事后Tukey检验，∗p < 0.05），其数值以相对于空肠菌群移植（JMT）组平均丰度的log2倍变化表示（红色表示高于JMT组，蓝色表示低于JMT组）。

（C-E）十二指肠-空肠、盲肠和结肠中经log2标准化的代谢物丰度的主成分分析（PCA）（JMT组，粉色；CMT组，橙色；FMT组，淡紫色；PBS组，灰色）。

（F-H）十二指肠-空肠和结肠中检测到的16种最丰富胆汁酸的靶向代谢组学分析及绝对定量，分别以总胆汁酸、次级胆汁酸百分比、结合型/非结合型胆汁酸表示（方差分析，事后Tukey检验，∗p < 0.05）。

（I）血浆中差异丰度代谢物的热图。对于任意两组间存在显著差异的代谢物（方差分析，事后Tukey检验，∗p < 0.05），其数值以相对于JMT组平均丰度的log2倍变化表示（红色表示富集，蓝色表示减少）。

（J）血浆中代谢物的主成分分析（PCA）（PERMANOVA检验，Mann-Whitney检验，JMT组 vs. FMT组，∗p < 0.05）。

（K-M）血浆中检测到的前16种胆汁酸的靶向代谢组学分析及绝对定量，分别以总胆汁酸、次级胆汁酸百分比、结合型胆汁酸百分比表示（方差分析，事后Tukey检验，∗p < 0.05）。所有误差线均表示±标准误（SE）。

无菌（GF）小鼠与抗生素处理（ABX）模型具有相似性

小鼠的食粪特性可能通过重复接种粪便菌群使粪菌移植（FMT）研究的解读变得复杂。此外，抗生素处理和原生菌群可能会影响供体菌群的定植（尽管在移植前有2天的时间让抗生素清除）。为了明确在没有竞争、抗生素作用以及通过食粪行为重复接种粪便菌群的情况下，小肠菌群（SBM）和大肠菌群（LBM）是如何定植的，我们将空肠菌群移植（JMT）和粪菌移植（FMT）应用于无菌（GF）小鼠（这类小鼠只能用移植的菌群进行自我再接种），并进行了16S rRNA扩增子测序和代谢组学分析。

与我们的抗生素处理后小鼠模型相似，我们发现移植类型和肠道区域会影响菌群组成（图3A和3B；未加权UniFrac距离，PERMANOVA检验，p = 0.001∗）。除回肠外，每个肠道区段都有独特的菌群群落（图S4A-S4E；未加权UniFrac距离，PERMANOVA检验，p=0.001∗）。尽管没有竞争性微生物，粪菌移植在小肠（SB）的定植效率仍不如大肠（LB）（约低20%）（图3C）。虽然空肠菌群移植的微生物在小肠的定植效率比粪菌移植的微生物高（约40%），但空肠菌群移植在大肠的定植率存在差异（20%-90%）。空肠菌群移植后，小肠的需氧菌和兼性厌氧菌定植增加；而粪菌移植后，厌氧菌定植增加（分别为图3D和3E）。然而，大肠中未发现这种差异。有趣的是，与空肠菌群移植-无菌小鼠相比，空肠菌群移植-无特定病原体（SPF）小鼠的小肠中需氧菌水平更高、厌氧菌水平更低，这可能是由于无菌小鼠小肠内氧气含量变异性较高所致（图3F和3G）。差异富集的微生物与无特定病原体小鼠中的情况相似，包括空肠菌群移植富集的需氧乳杆菌属，以及粪菌移植富集的瘤胃球菌科、真杆菌属、科里杆菌科、粪杆菌属和肠杆菌属（图3H；MaAsLin2分析，p < 0.05）。这些与无特定病原体动物的代谢物特征相关，包括空肠菌群移植富集的肠道氨基酸、短链脂肪酸减少、十二指肠-空肠和结肠中总胆汁酸增加、结肠中结合型胆汁酸增加以及次级胆汁酸减少（图S4F-S4I；数据S1）。综上所述，这些数据表明，在没有抗生素、原生菌群竞争以及粪便菌群再接种等复杂因素的情况下，无菌小鼠在整个肠道中表现出相似的定植模式和代谢物特征，包括小肠内的厌氧菌定植。此外，无菌小鼠的区域和全身胆汁酸库发生改变，这与我们的抗生素处理后小鼠以及已知可防止食粪行为的“粪便收集”杯模型一致，包括总胆汁酸增加和次级胆汁酸减少。

图3.无菌小鼠与抗生素处理模型具有相似性

（A和B）菌群移植后1个月肠道内容物的16S rRNA测序结果。基于未加权UniFrac距离的所有样本β多样性主坐标分析（PCoA），按移植类型着色（A）（空肠菌群移植[JMT]，粉色；粪菌移植[FMT]，淡紫色）和按肠道区域着色（B）（小肠，红色；大肠，蓝色；PERMANOVA检验，所有空肠菌群移植组与粪菌移植组、小肠组与大肠组比较，∗p < 0.001）。

（C）移植转移效率，计算方式为移植菌群中扩增子序列变体（ASVs）总数占移植物中扩增子序列变体总数的百分比（单因素方差分析，事后Tukey检验，粪菌移植组的十二指肠-空肠和回肠相对于盲肠和近端结肠比较，∗p < 0.05）。

（D）小肠内空肠菌群移植组的需氧菌+兼性厌氧菌百分比更高（方差分析，事后Tukey检验，∗p < 0.05）。

（E）粪菌移植后小肠内厌氧菌百分比更高（方差分析，事后Tukey检验，∗p < 0.05）。

（F和G）无特定病原体（SPF）小鼠与无菌（GF）小鼠中需氧菌+兼性厌氧菌或厌氧菌丰度的比较（方差分析，事后Tukey检验，∗p < 0.05）。

（H）线性判别分析效应量（LEfSe）用于检测各区域中差异丰度的微生物。

本图缩写包括：DJ，十二指肠-空肠；JE，空肠；IL，回肠；CE，盲肠；CO，结肠；PC，近端结肠；DC，远端结肠。所有误差线均表示±标准差（SD）。

菌群移植会驱动不同的肝脏转录程序，这种影响可持续长达3个月，并改变能量平衡

许多胆汁酸、碳水化合物和氨基酸具有生物活性，作为信号分子并在总营养通量中对代谢产生重大影响。肠道中的代谢物通过整个肠道被吸收，由肠道血管系统收集，再经肝门静脉进入肝脏。肝脏是人体主要的代谢器官，也是肠道外首个接触微生物产物的器官。鉴于肠道定植、代谢物库的变化以及小肠菌群（SBM）在代谢中的作用，我们探究了区域微生物群错配对肝脏等远端器官的影响。

我们通过RNA测序（RNA-seq）检测了菌群移植（MT）后的肝脏转录谱。各组移植后的肝脏转录组具有独特特征，其中空肠菌群移植（JMT）组与粪菌移植（FMT）组之间的差异最显著（PC1贡献率为16.57%），而盲肠菌群移植（CMT）组则呈现中间表型（PERMANOVA检验，所有组间两两比较均p < 0.05）（图4A）。差异基因表达分析证实，JMT组与FMT组之间的差异最大，存在3928个差异表达基因（DEGs）（图4B）。JMT组与CMT组之间发现2504个差异表达基因，FMT组与CMT组之间发现1805个差异表达基因（DESeq2分析，校正后p值< 0.05）（图4C和4D）。值得注意的是，JMT组中富集了代谢和脂质相关基因，包括含ELMO结构域蛋白3（Elmod3）、细胞色素P450家族成员Cyp4a14和Cyp4a32、围脂滴蛋白5（Plin5）、过氧化物酶体生物发生因子11α（Pex11a）、溶质载体Slc25a47以及酰基辅酶A硫酯酶（Acot）1/2。FMT组中富集的血清淀粉样蛋白A3（Saa3）、脂笼蛋白2（Lcn2）、 Ephrin A3（Efna3）、白细胞介素33（Il-33）、T细胞受体相关跨膜衔接蛋白1（Trat1）和α激酶1（Alpk1）均参与免疫功能。为了更好地理解基因表达差异，我们将表达谱映射到KEGG数据库通路中（使用fGSEA R包，校正后p值< 0.05）。通路分析显示，FMT组富集的14条KEGG通路中，有10条与免疫相关，包括“致病性大肠杆菌感染”“细胞因子-细胞因子受体信号传导”“趋化因子信号传导”“RIG-I样受体信号传导”“Toll样受体信号传导”和“NOD样受体信号传导”。相反，JMT组富集的主要通路与代谢相关，包括“PPAR信号传导”“氧化磷酸化”“脂肪酸代谢”“不饱和脂肪酸合成”“支链氨基酸降解”和“亚油酸代谢”（图4E）。移植后3个月仍能检测到转录变化（图S5），且在无菌（GF）小鼠中也观察到了类似变化（图4F；数据S1），这表明肝脏转录组的改变具有持久性，且是微生物移植的直接效应。

鉴于对肝脏代谢通路存在影响，我们利用代谢笼对这些小鼠的能量平衡进行了研究，并评估了其摄食行为、活动量、能量消耗及营养利用情况（采用Sable Systems公司的Promethion系统）。1个月后，空肠菌群移植（JMT）组小鼠体重最重、体重增量最大，且能量消耗最低（图4G、4H和4K；方差分析，p < 0.05），活动量也最低（图4J；方差分析，p < 0.05）。粪菌移植（FMT）组小鼠的食物摄入量在所有组中最低，但与JMT组相比，能量消耗水平更高（图4I；方差分析，p < 0.05）。有趣的是，从活动量、食物摄入量、体重维持及体重变化、能量消耗等指标来看，盲肠菌群移植（CMT）组小鼠的代谢最为活跃（图4G-4K；与CMT组的所有比较均采用方差分析，p < 0.05）。CMT组小鼠的呼吸交换率（RER）较低，这表明其脂质氧化增强，与能量消耗增加及以脂肪作为能量来源的利用方式一致（图4L；方差分析，p < 0.05）。

此外，通过对细菌宏基因组鸟枪法测序数据与肝脏RNA测序数据的跨组学分析，我们确定了可能加剧JMT与FMT所致肝脏转录变化的潜在菌株（图S3L）。我们重构了87个高质量的宏基因组组装基因组（MAGs），并进行功能富集分析，以识别在JMT组或FMT组中含富集功能的差异丰度MAGs。利用稀疏峰值关联关系相关计算（SPARCC），将MAG丰度变化与肝脏转录变化进行比较，并将这两项分析结果分别绘制在x轴和y轴上，以识别与肝脏转录组上调或下调相关的特定菌株（图S3M）。我们发现有5组基因与特定细菌基因组相关。例如，与线粒体降解和过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARA）相关的第2组基因，与FMT组富集的拟杆菌属_03（Bacteroides_03）和穆里巴库鲁姆菌属_02（Muribaculum_02）基因组呈负相关；而与线粒体和呼吸通路相关的第1组基因，则与FMT特异性基因组脱硫弧菌属_01（Desulfovibrio_01）和拟杆菌属_02（Bacteroides_02）相关（完整的MAG特征及基因关联详见表S1）。综上所述，这些数据凸显了小肠菌群（SBM）和大肠菌群（LBM）在与生态系统错配时对宿主产生的双重影响，特别是它们分别对代谢调节和免疫调节产生的不同作用，以及同时重建小肠菌群和大肠菌群可能带来的潜在益处。

图4.菌群移植会驱动不同的肝脏转录程序，这种程序不仅具有持久性，还会改变能量平衡

（A）菌群移植后1个月肝组织的RNA测序分析。通过DESeq2分析计数来呈现肝脏转录组的相对差异，并以主成分分析可视化，按移植类型着色。磷酸盐缓冲液（PBS）组，灰色；空肠菌群移植（JMT）组，粉色；盲肠菌群移植（CMT）组，橙色；粪菌移植（FMT）组，淡紫色（主成分分析，PC1贡献率16.57%，PC2贡献率11%；PERMANOVA检验，∗p < 0.001，空肠菌群移植组vs.粪菌移植组）。

（B-D）空肠菌群移植组与粪菌移植组、盲肠菌群移植组与粪菌移植组、空肠菌群移植组与盲肠菌群移植组之间差异表达基因的火山图。

（E）京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，展示差异富集的代谢通路（蓝色）、免疫通路（红色）及其他通路（黑色）（使用fGSEA R包）。

（F）无菌（GF）小鼠与无特定病原体（SPF）小鼠中差异富集通路的比较。

（G-J）利用Sable Systems Promethion呼吸测量系统进行的能量平衡评估，显示空肠菌群移植组与粪菌移植组小鼠在体重、体重增长、食物摄入和活动量方面存在差异（方差分析，∗p < 0.05）。

（K和L）相对于磷酸盐缓冲液组，所有移植组在能量消耗和营养利用方面均存在差异（方差分析，∗p < 0.05），数据为76小时记录轨迹。所有误差线均表示±标准差（SD）。

小肠菌群和大肠菌群会改变非原生的肠道区域生态系统，使其更有利于自身的定植和存活

显然，移植原生微生物与非原生微生物会使微生物群的组成和功能发生显著变化，进而影响宿主代谢及远端器官（如肝脏）。因此，我们认为有必要明确肠道区域生态系统对原生与非原生微生物存在的应答机制，并对空肠和结肠黏膜进行了RNA测序（RNA-seq）。结肠和空肠转录组的主成分分析（PCA）显示，主成分1（PC1）可解释87%的变异，凸显了基因表达的巨大差异（图5A）。与代谢组和肝脏的特征相似，我们发现粪菌移植（FMT）组与磷酸盐缓冲液（PBS）组的肠道特征非常相似，这是由于在有食粪行为的动物中，大肠微生物会反复接种。我们注意到，FMT组小鼠空肠的PC1差异小于结肠样本，表明其与结肠组织存在一定相似性（约20%）。为进一步探究这一现象，我们检测了空肠和结肠标记基因的表达。与FMT组和PBS对照组相比，空肠菌群移植（JMT）组小鼠的空肠黏膜中富集了空肠特异性基因（方差分析，p < 0.05）（图5B）。这些基因包括空肠特性的核心转录调控因子——Gata4和Gata6（G-A-T-A结合蛋白）；脂质结合与转运基因，如载脂蛋白Apoa1、Apoa4，以及分化簇36/脂肪酸转运蛋白（Cd36/Fat）；还有糖转运蛋白/溶质载体家族成员Slc2a2、Slc2a5和Slc5a1。JMT组大多数糖转运蛋白的表达水平更高（见数据S1）。在结肠中，FMT组的结肠特异性基因表达水平更高，包括驱动结肠特性的Satb2；钙激活氯离子通道调节因子1（Clca1）、碳酸酐酶1（Car1）、淋巴细胞抗原6家族成员G（Ly6g）和桥粒芯糖蛋白2（Dsg2）；结肠特异性水转运蛋白水通道蛋白8（Aqp8）；以及短链脂肪酸转运蛋白Slc16a3和Slc5a8（方差分析，p < 0.05）（图5C）。有趣的是，FMT后，空肠中通常表达的抗菌肽富集，包括α防御素3（Defa3）、溶菌酶Lyz1、Lyz2和基质金属蛋白酶（Mmp7），且这与Paneth细胞发育相关基因——Erb-B2受体酪氨酸激酶3（Erbb3）和atonal同源基因1（Atoh1）的变化一致（见数据S1）。

这些数据表明，错配的非原生微生物可以重新编程组织特性，增强有利于其适应和定植的基因表达。这也解释了为何单次粪菌移植（FMT）后3个月，空肠中仍持续存在厌氧菌。为了量化空肠菌群移植（JMT）和粪菌移植对空肠和结肠区域生态系统的改变程度，我们分析了健康、未接受抗生素处理的C57Bl6小鼠空肠和结肠黏膜刮取物的RNA测序数据，并筛选出排名前1000的差异表达基因（图5D和5E；校正后p值<0.05，log2倍变化>2）。基于这些基因，我们构建了“空肠特征”和“结肠特征”基因集，用于对移植后肠道组织进行富集分析。结果发现，在空肠中，JMT使空肠特征基因集富集（标准化富集得分[NES]=2.48，校正后p值=2.75e−22），而FMT则增强了结肠特征基因集的富集（NES=1.54，校正后p值=2.83e−3）（图5F）。结肠中也观察到类似模式：JMT使空肠特征基因集富集（NES=1.52，校正后p值=8.49e−5），FMT则增强了结肠特征基因集的富集（NES=2.48，校正后p值=3.35e−16）（图5G）。其中，JMT对空肠中“空肠特征”的驱动作用更强，FMT对结肠中“结肠特征”的驱动作用更显著（校正后p值分别为e−22和e−16）。对这些基因的可视化分析证实，JMT后空肠相关程序增强，FMT后结肠相关程序增强。

鉴于GATA4在调控小肠特性中的作用，以及SATB2在调控结肠特性中的作用，我们通过蛋白质印迹（WB）和免疫组织化学（IHC）技术，检测了移植后1个月这两种转录调控因子的蛋白水平是否在JMT或FMT后升高（图S6）。蛋白质印迹结果显示，与磷酸盐缓冲液（PBS）对照组相比，JMT使空肠中GATA4蛋白水平升高（p=0.01），FMT使结肠中SATB2水平升高（p=0.01）（图S6）。有趣的是，免疫组织化学结果显示，部分空肠隐窝细胞表达SATB2，而结肠隐窝中GATA4水平升高，这表明肠道区域特性可能向改变后的方向发展，从而为微生物在非原生环境中的定植创造更有利条件。这些数据表明，微生物群会增强其原生环境的区域生态系统（JMT增强空肠生态系统，FMT增强结肠生态系统），并抑制非原生区域生态系统，使其更符合自身原生环境的特征。

图5.小肠和大肠微生物群会将其所在的区域生态系统调节为更接近原生的环境

（A）菌群移植后1个月肠道黏膜组织的RNA测序分析。结肠和空肠组织的主成分分析（PCA）显示，粪菌移植（FMT）组空肠组织的特征向结肠样本偏移；空肠菌群移植（JMT）组，粉色；FMT组，淡紫色；磷酸盐缓冲液（PBS）组，灰色。

（B和C）空肠中空肠标记基因的表达以及结肠中结肠标记基因的表达，以每百万转录本（TPM）表示（方差分析，事后Tukey检验，∗p < 0.05）。

（D和E）健康、未接受抗生素处理的C57Bl6小鼠空肠和结肠转录组的主成分分析（PCA），并使用排名前1000的差异表达基因（log2倍变化>2，校正后p值<0.05）构建空肠和结肠基因集。

（F）空肠组织的通路分析显示，空肠菌群移植后空肠特征富集（标准化富集得分[NES]=2.48，∗校正后p值=2.75e−22），而粪菌移植后结肠中结肠特征富集（NES=1.54，∗校正后p值=2.84e−3）。

（G）结肠组织的通路分析显示，空肠菌群移植后空肠特征富集（NES=1.52，∗校正后p值=8.48e−5），而粪菌移植后结肠中结肠特征富集（NES=2.48，∗校正后p值=3.35e−16）。所有误差线均表示±标准差（SD）。

人类粪菌移植也会导致结肠厌氧菌在上段小肠中持续存在，并会重新编程区域生态系统，使其更有利于自身的定植

小鼠模型是宝贵的研究工具，但当然无法完全重现人类生物学的所有方面。因此，我们研究了从小鼠研究中得出的结论是否能在人体组织中得到类似观察。为此，我们采用两种方法来探究小肠（SB）与大肠（LB）微生物对人体组织的影响：（1）用空肠菌群移植（JMT）和粪菌移植（FMT）的无细胞成分处理从空肠活检样本培养的原代人空肠类器官（肠类器官）；（2）分析接受粪菌移植的患者在移植前和移植后1个月的十二指肠活检样本。

将体外培养的原代人空肠活检样本（n=8名受试者）分别用10%的无细胞制剂处理——该制剂来自单一空肠造口术供体的人空肠内容物或粪便匀浆，分别模拟空肠菌群移植和粪菌移植（图6A）。提取纯化的RNA进行RNA测序，并将每种处理与其自身的载体对照组（VEH）进行比较。尽管我们并未观察到体内模型中所有标记特性转换的基因特征——且在人类中，这些基因并非严格意义上的空肠特异性基因（如嗅觉素[OLFM4]、脂肪酸结合蛋白6[FABP6]、载脂蛋白A4[APOA4]和肠碱性磷酸酶[APLI]）或结肠特异性基因（如SATB2、尾型同源盒2[CDX2]、碳酸酐酶1[CA1]和乳过氧化物酶[LPO]）——但在空肠菌群移植和粪菌移植处理后24小时内，分别检测到与小鼠模型中相似的特性信号增强，这表明微生物介导的空肠与结肠之间的特性转换并非即时发生（图6B；方差分析，∗p < 0.05）。通路分析显示，空肠菌群移植处理的肠类器官中，脂质吸收、转运、生物合成和储存通路，以及碳水化合物生物合成和利用通路均富集（图6C；数据S1）。然而，粪菌移植处理的肠类器官中，与脂质和碳水化合物代谢相关的通路表达下调。重要的是，“脂质生物合成通路”在空肠菌群移植处理的肠类器官中富集，而在粪菌移植处理的肠类器官中下调（图6C），这体现了小肠微生物群增强脂质、碳水化合物及其他代谢过程的能力。尽管还需要进一步研究来评估对特定人类特性标志物的影响，但这些数据证实了我们从体内小鼠模型中得出的结论。

为进一步验证这些研究结果的可转化性，我们重新分析了图1中的粪菌移植（FMT）受试者队列，并对其组织进行了RNA测序（移植前n=7，移植后n=7）。十二指肠转录组分析显示，移植前与移植后样本之间无统计学差异（图6D；PERMANOVA检验，p > 0.05）。然而，我们发现十二指肠转录组的变化与厌氧菌定植水平的升高相关，这表明个体间的应答差异取决于FMT的定植情况（Spearman相关系数R = 0.73，双尾p = 0.009）（图6E）。我们观察到SATB2表达增加（Student’s t检验，∗p = 0.39），且183个上调的结肠基因呈现出富集的结肠特征（标准化富集得分[NES] = 1.52，校正后p值 = 3.1e−4）（图6F-6H）。通路分析显示，十二指肠内耗氧过程增强，包括线粒体表达、氧化磷酸化和有氧呼吸（图6I；NES > 2，校正后p值 < 0.05）。小肠内耗氧量的增加可能会降低管腔氧水平，形成更厌氧的环境，从而有利于厌氧菌定植。综上所述，这些数据验证了我们的小鼠研究结果，证实微生物能够改变黏膜生态系统，使其符合自身原生环境的特征，且这些过程也可能在人类中发生。

图6.人体组织呈现出代谢和区域生态系统的变化

（A）将原代人空肠活检样本进行体外培养以生成空肠肠类器官，用人类空肠菌群移植（JMT，取自空肠造口袋）或粪菌移植（FMT，取自升结肠灌洗液）的无细胞制剂处理24小时后，提取RNA并进行测序。

（B）粪菌移植使结肠标记基因SATB2、CDX2、CA1和LPO富集；空肠菌群移植使空肠标记基因OLFM4、FABP4、APOA4和ALPI富集，以每百万转录本（TPM）表示（方差分析，事后Tukey检验，∗p < 0.05）。

（C）基因本体论（GO）通路“脂质生物合成过程”的基因富集排名列表。

（D）通过上消化道内镜进行人类粪菌移植，将其送达十二指肠末端（n = 7名受试者）。在粪菌移植前及移植后4周的随访内镜检查中采集人十二指肠活检样本，进行RNA测序和16S rRNA测序。十二指肠转录组的主成分分析（PCA）显示，粪菌移植前后无显著变化（PERMANOVA检验，Mann-Whitney检验，p > 0.05）。

（E）粪菌移植后，定植于十二指肠黏膜的厌氧菌相对丰度增加，且与十二指肠转录组的变化相关（Spearman相关系数r = -0.73；∗p = 0.009）。

（F）粪菌移植前后十二指肠活检样本中Satb2的表达，以每百万转录本（TPM）表示（双尾t检验，∗p < 0.05）。

（G和H）结肠特征基因集的富集分析显示，粪菌移植后该基因集富集（标准化富集得分[NES] = 1.52，校正后p值 = 3.1e−4），共183个结肠基因富集。

（I）基因本体论通路分析表明，粪菌移植后线粒体通路、氧化磷酸化通路和有氧呼吸通路富集（fGSEA，GO通路，∗校正后p值 < 0.05，NES > 2）。所有误差线均表示±标准差（SD）。

作者简介

Orlando DeLeon(第一作者)

Orlando DeLeon是Eugene B. Chang教授实验室的博士后，他们正在积极探索粪菌移植（FMT）技术，即通过移植健康捐赠者的粪便来治疗多种与肠道菌群相关的疾病，如炎症性肠病（IBD）。粪菌移植的内容物主要包含大肠中的细菌，而这些细菌在小肠中并不常见。因此，来自大肠的粪便移植无法恢复小肠的功能，反之亦然。这种微生物的不匹配还会导致行为和代谢方面的改变。令人担忧的是，他们在小鼠身上发现的这些变化，在接受粪菌移植的人类身上也同样出现了。目前，他们需要弄清楚肠道中哪些特定细胞发生了变化，以及如何进行干预。

Mora Mocanu(第一作者)

Mora Mocanu博士在昆士兰大学医学院获得医学学位，在迈阿密的杰克逊纪念医院完成儿科住院医师培训，在芝加哥的科默儿童医院完成儿科胃肠病学专科培训，是伊利诺伊州温菲尔德的一名儿科医生，隶属于芝加哥Ann & Robert H. Lurie儿童医院。

Eugene B. Chang(通讯作者)

张教授及其团队专注于研究肠道微生物及其与宿主的相互作用，这种关系对人类健康至关重要，一旦被破坏可能产生严重后果。张博士的工作探讨了过去一个世纪的环境和生活方式变化如何改变了人类微生物组，导致了糖尿病、肥胖、代谢综合征、癌症和自身免疫性疾病等“新时代”疾病的兴起。在遗传易感个体中，这些转变会破坏免疫和代谢稳态，从而可能引发疾病的发作。

张教授的实验室致力于了解影响肠道微生物群落选择和组装的因素，目标是利用这些知识重塑肠道微生物组，以预防和治疗疾病。该团队采用尖端方法，包括培养依赖性和独立性微生物分析、转基因和认知生物小鼠模型、代谢和功能分析以及先进的生物信息学来研究宿主和微生物组。

研究和学术兴趣：微生物组、炎症、粘膜免疫、炎症性肠病、新陈代谢。

Martinez-Guryn(通讯作者)

Martinez-Guryn博士同时也是一名注册营养师，她于2011年在北卡罗来纳大学格林斯伯勒分校（UNCG）获得博士学位。次年，她在UNCG完成了营养学实习，并于2012年底加入芝加哥大学医学系胃肠病学、肝病学和营养科的Eugene Chang博士实验室进行博士后培训。2017年8月，Martinez-Guryn博士加入中西部大学生物医学科学项目，担任助理教授。

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