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山梨酸钾通过调控细胞间通讯诱发肾损伤：一项整合网络毒理学、机器学习、分子对接与单细胞RNA测序的研究
iMetaMed主页：https://onlinelibrary.wiley.com/journal/3066988x
研究论文
● 原文：iMetaMed
●英文题目：Potassium Sorbate Triggers Kidney Injury via Dysregulated Intercellular Communication: A Study Combining Network Toxicology, Machine Learning, Molecular Docking, and Single-Cell RNA Sequencing
●中文题目：山梨酸钾通过调控细胞间通讯诱发肾损伤：一项整合网络毒理学、机器学习、分子对接与单细胞RNA测序的研究
● 原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/imm3.70017
● DOI: https://doi.org/10.1002/imm3.70017
● 2025年11月23日，土耳其塞尔丘克大学Gokhan Zengin、内蒙古医科大学药学院张谦与上海交通大学医学院附属仁济医院李梦尧团队在iMetaMed在线发表了题为“Potassium Sorbate Triggers Kidney Injury via Dysregulated Intercellular Communication: A Study Combining Network Toxicology, Machine Learning, Molecular Docking, and Single-Cell RNA Sequencing”的研究文章。
● 该研究首次系统整合网络毒理学、机器学习、分子对接、分子动力学模拟与单细胞RNA测序，揭示了常用食品防腐剂山梨酸钾通过干扰细胞间通讯诱导急性肾损伤的分子机制，为食品添加剂的安全性评估提供了新的研究范式。
● 第一作者：吴奕懋、梁亚伦、梁晋涛
● 通讯作者：Gokhan Zengin（gokhanzengin@selcuk.edu.tr）、张谦（bioqzhang@immu.edu.cn）、李梦尧（limy@sjoc.ac.cn）
● 主要单位：上海交通大学医学院附属仁济医院、上海市肿瘤研究所、广东医科大学、内蒙古医科大学、土耳其塞尔丘克大学
亮点
● 首次系统整合网络毒理学、机器学习、分子对接、分子动力学与单细胞分析，揭示PS诱导肾损伤的多维度机制；
● 锁定关键基因APP：通过机器学习筛选出淀粉样前体蛋白（APP） 为PS致肾损伤的核心调控基因；
● 揭示细胞通讯新机制：单细胞分析首次发现APP通过APP-CD74 与 APP-PTGER2 配体-受体轴介导内皮细胞-免疫细胞互作；
● 提出新毒性机制：PS通过氧化应激、炎症反应、代谢紊乱等途径诱导肾小管功能障碍；
●构建多维评估框架：为食品添加剂与环境毒素的安全性评估提供了创新方法学支撑。
摘要
急性肾损伤（AKI）是一种具有高死亡率、并可能进展为慢性肾病的临床重要综合征。山梨酸钾（PS）是一种广泛使用且被认为具有高安全性的食品防腐剂，现已被识别为诱导急性肾损伤的潜在风险因素。然而，其潜在肾毒性机制，特别是与AKI发病的关联，尚不清楚。本研究综合运用网络毒理学、分子对接、分子动力学模拟、机器学习及单细胞分析等多种方法，全面探讨了PS诱导肾损伤的分子机制。研究结果表明，PS与基质金属肽酶9（MMP9）和淀粉样前体蛋白（APP）等关键靶标相互作用，影响脂质代谢、动脉粥样硬化以及AGE-RAGE信号通路。这些相互作用触发了氧化应激、炎症反应和代谢紊乱，从而促进了急性肾损伤的发生。通过机器学习筛选，确定APP为关键调控基因。此外，单细胞分析揭示，APP通过APP-CD74和APP-PTGER2配体-受体对，介导了内皮细胞与免疫细胞之间的相互作用。这为理解PS诱导的肾小管炎症和微环境失衡提供了新的细胞学证据。本研究不仅为评估PS的肾毒性提供了系统的科学证据，而且为食品添加剂的安全性评估及急性肾损伤分子机制的探索，引入了一个整合多维度研究手段的创新范式。
视频解读
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全文解读
引 言
急性肾损伤（AKI）是一种严重的临床综合征，其特征是肾小球滤过率在短时间内迅速下降，导致体内水、电解质及代谢废物的潴留。AKI因其高发病率和高死亡率而成为一个全球性的健康挑战。它不仅是慢性肾病（CKD）进展的独立预测因子，同时还显著增加心血管事件和终末期肾病的风险，从而给全球公共卫生系统带来沉重负担。AKI的病因复杂且多样，常由多种因素触发，包括缺血-再灌注、肾毒性药物（如化疗药物和抗生素）、严重感染、脓毒症以及衰老等。在分子水平上，其机制涉及炎症、氧化应激、细胞凋亡等复杂病理生理过程的相互作用，这些机制尚未被完全阐明。因此，超越传统视角，从系统层面对包括食品添加剂在内的环境肾毒性物质的致病机制进行深入探索，已日益成为必要，这也构成了当代肾脏病学研究的一个关键前沿。
山梨酸钾（PS）是一种广泛使用的食品防腐剂，尤其因其对真菌和酵母的有效抑制作用而被普遍认为安全。然而，新出现的毒理学证据对其长期安全性提出了质疑。多项研究表明，PS可能通过诱导氧化应激、破坏线粒体功能、引发脂质过氧化等途径，在多种器官系统中表现出细胞毒性和遗传毒性。作为代谢和排泄的主要器官，肝脏和肾脏是其潜在靶标。尽管有零星研究提示PS可能损害肾功能，但关于其在引起肾损伤中的具体分子靶点、信号通路和细胞间通讯机制，仍存在显著的知识空白，并且缺乏系统性和多维度的验证与整合方法。
网络毒理学是系统生物学中的一种创新方法，它整合了化合物靶标预测、蛋白质相互作用网络分析、通路富集、分子对接和分子动力学模拟等技术。这种方法有助于从整体视角揭示化学物质的毒理机制。与传统毒理学研究相比，网络毒理学在识别关键靶点、预测信号通路和构建机制网络方面具有独特优势，这些要素共同提供了对毒理学的多维洞察。进一步整合机器学习算法使得能够从高通量数据中筛选关键生物标志物。此外，单细胞转录组分析（scRNA-seq）可以在细胞水平阐明细胞间通讯和异质性，从而提供更高分辨率的机制证据。这种整合多种方法学的策略已成为当代毒理学研究的新范式。
本研究旨在采用整合策略，系统阐明PS诱导肾损伤的分子机制。首先，通过网络毒理学识别潜在靶点并构建蛋白质相互作用网络。随后采用分子对接确认关键结合相互作用，并应用机器学习从临床样本数据中筛选核心基因。最后利用单细胞转录组数据验证这些基因在细胞微环境中的功能。本研究不仅为PS的肾毒性提供了新的见解，也凸显了多学科交叉整合策略在当代毒理学安全评价中的巨大潜力和应用价值。
结 果
PS毒性预测、核心靶点筛选与功能通路分析
本研究首先对山梨酸钾（PS）进行了系统的生物信息学分析。通过ProTox-3.0毒性预测平台确认PS具有肾毒性潜力（图2A-B）。进一步通过数据库挖掘获得374个PS作用靶点与4037个肾损伤相关靶点，取其交集得到238个PS诱导肾损伤的潜在关键靶点（图2C）。利用蛋白相互作用网络分析（图2D）并结合MCODE评分与Degree中心性拓扑特征，最终筛选出10个核心靶标用于后续验证。
对238个交集靶点进行的基因功能富集分析显示，这些靶点显著富集于肽基-酪氨酸磷酸化、生长因子受体信号转导等生物过程；在细胞组分方面主要分布于受体复合物等结构；分子功能则涉及核受体活性、激酶活性等（图2E）。京都基因与基因组百科全书通路分析进一步揭示，这些靶点主要参与癌症通路、脂质与动脉粥样硬化、前列腺癌、AGE-RAGE糖尿病并发症信号通路等重要病理过程（图2F）。这些结果为阐释PS诱导肾损伤的分子机制提供了重要的理论依据。
图2. PS毒性分析、靶点鉴定及功能富集分析
（A）PS化学结构图（B）PS毒性分析雷达图（C）PS与肾损伤靶点交集的韦恩图（D）使用Cytoscape 3.10.2绘制的靶点可视化网络图（紫色节点代表PS与肾损伤的共同靶点，绿色边表示靶点间的相互作用关系。节点大小与其度中心性成正比，颜色深浅反映介数中心性）（E）GO富集分析条形图（展示各分类中p值最小的前10个功能/通路）（F）KEGG富集分析气泡图（展示p值最小的前20条通路）
核心靶点的分子对接验证
在PS与筛选出的关键靶点之间进行了分子对接验证（图3）。结合能计算使用AutoDock Vina完成，结合能越小表明配体与受体之间的结合活性越强、亲和力越高，形成的结构越稳定。我们的研究结果显示，所有小分子与PS均具有良好的结合亲和力。其中，MMP9表现出最有利的结合能（-5.7 kcal/mol），表明其与PS的相互作用非常强。此外，所有配体-大分子复合物之间的相互作用均由氢键介导，这确保了结合的稳定性。
图3. 山梨酸钾与核心靶点的分子对接结果
（A）PS与MMP9的分子对接结果（结合能：-5.7 kcal/mol）（B）PS与MMP2的分子对接结果（结合能：-5.4 kcal/mol）（C）PS与APP的分子对接结果（结合能：-4.9 kcal/mol）（D）PS与PTGS2的分子对接结果（结合能：-4.9 kcal/mol）（E）PS与SIRT1的分子对接结果（结合能：-4.8 kcal/mol）（F）PS与CXCR4的分子对接结果（结合能：-4.7 kcal/mol）（G）PS与TLR4的分子对接结果（结合能：-4.7 kcal/mol）（H）PS与MAPK1的分子对接结果（结合能：-4.6 kcal/mol）（I）PS与PPARG的分子对接结果（结合能：-4.5 kcal/mol）（J）PS与STAT1的分子对接结果（结合能：-4.4 kcal/mol）
分子动力学模拟
RMSD用于评估模拟系统的平衡性和复合物构象的稳定性。如图4A所示，复合物系统在20 ns后达到平衡，最终在3 Å和2.8 Å附近波动，表明小分子与靶蛋白结合时具有高稳定性。回转半径（Rg）描述了整体结构的变化，可表征蛋白质结构的紧密度，复合物系统在运动过程中显示出轻微波动，表明小分子-靶蛋白复合物在运动过程中发生了构象变化（图4B）。溶剂可及表面积（SASA）是评估蛋白质表面积的指标。计算结果显示复合物系统表现出轻微波动，表明小分子的结合影响了结合微环境，导致SASA发生了一定程度的变化（图4C）。
氢键在配体与蛋白质结合中起重要作用。小分子与靶蛋白之间的氢键数量在0到5之间（图4D），在大多数情况下，复合物具有约3个氢键，表明该配体与靶蛋白具有良好的氢键相互作用。均方根波动（RMSF）代表了蛋白质中氨基酸残基的灵活性。如图4E所示，该复合物的RMSF值相对较低（大多低于3 Å），表明其灵活性较低，稳定性较高。自由能景观（FEL）图展示了基于蛋白质和配体分子动力学模拟过程中的RMSD和Rg计算出的自由能分布（图4F）。
随后，利用MM/PBSA方法计算了复合物结合构象的结合自由能（图4G）。复合物系统的结合自由能为-11.29 kcal/mol。该负值表明该分子对靶蛋白具有结合亲和力，且数值越低表示结合越强。因此，该复合物系统具有相对较高的亲和力。进一步分析了对复合物系统中小分子结合有显著贡献的氨基酸，结果表明残基GLY74、PHE108和LYS107具有高贡献值（图4H），这些氨基酸残基可能在催化过程中起重要作用。
总之，复合物系统结合稳定，复合物表现出良好的氢键相互作用，小分子与靶蛋白结合良好。
图4. 蛋白质-配体复合物的分子动力学模拟分析
（A）蛋白质-配体复合物的RMSD随时间变化曲线（B）蛋白质-配体复合物的Rg值随时间变化曲线（C）蛋白质-配体复合物的SASA值随时间变化曲线（D）蛋白质-配体复合物的氢键数量随时间变化曲线（E）蛋白质-配体复合物的RMSF分析（F）自由能景观图（G）APP-山梨酸钾复合物的MMPBSA结合自由能组分分解（H）APP-山梨酸钾相互作用的MMPBSA结合自由能逐残基分解（注：RMSD：均方根偏差；RMSF：均方根涨落；SASA：溶剂可及表面积）。
通过机器学习筛选出淀粉样前体蛋白（APP）
在机器学习分析中，PCA分析显示，在进行批次效应校正前，不同数据库的样本聚类分散，存在明显的批次效应（图5A）。处理后的样本聚类更加集中，表明批次效应已被有效消除，数据可靠性得到提高（图5B）。ROC曲线显示，随机森林（RF）模型的曲线下面积（AUC）为0.899，是所有模型中最高的，表明其预测准确性最佳（图5C）。在绝对残差值的反向累积分布图中，RF曲线位于顶部，意味着具有小残差的样本比例最高，模型拟合效果最好（图5D）。绝对残差值的箱线图也证实了这一点，RF的箱体最窄，残差的均方根（红点）最低，进一步表明其拟合效果优于其他模型，而LASSO模型的残差最大（图5E）。通过对通过"度"、MCODE和RF筛选的基因进行交集分析，最终确定APP是唯一的共有基因（图5F），表明APP是PS诱导肾损伤的关键基因。
图5. 机器学习分析结果
（A）去除批次效应前的PCA图（B）去除批次效应后的PCA图（C）六种机器学习模型的ROC曲线（D）绝对残差值的反向累积分布图（E）绝对残差值的箱线图（红点代表残差的均方根值）（F）韦恩图展示通过度值、MCODE和随机森林模型筛选基因的交集结果
配体APP通过2类受体与3种细胞类型进行通讯
在单细胞分析中，质量控制结果通过设置特征计数在20-2500之间和线粒体基因比率低于20%的阈值，筛选出了高质量细胞，为后续分析提供了可靠基础（图6A）。通过比较数据整合前后的UMAP图可以看出，整合前不同批次的样本聚类是分离的，批次效应明显，而整合后样本的混合聚类表明批次效应已被消除，细胞分布更能反映真实差异（图6B）。自动细胞注释结果清晰地显示了样本中的细胞类型和分布，其中内皮细胞和免疫细胞（如单核细胞、NK细胞、B细胞等）是主要的细胞群体，为细胞间通讯分析奠定了基础（图6C）。细胞间通讯分析揭示，配体APP通过APP-CD74和APP-PTGER2途径与三种特定细胞类型——内皮细胞、单核细胞和自然杀伤（NK）细胞——进行交互。分析显示，内皮细胞与单核细胞、NK细胞和B细胞之间存在强烈的通讯信号（箭头较宽）。结合相关数据，这种通讯是通过APP-CD74和APP-PTGER2途径实现的，表明APP介导的内皮-免疫细胞通讯是PS诱导肾损伤的重要机制（图6D，表S2）。
图6. 单细胞分析结果
（A）质量控制（从左至右：特征基因数、总分子数、线粒体基因百分比）（B）数据整合（上：整合前，下：整合后）（C）自动细胞注释（D）细胞间通讯分析（箭头宽度表示通讯强度）
PS诱导肾小管细胞功能障碍的体外验证
为了通过实验验证PS对肾细胞的毒性作用及其对肾小管细胞功能的影响，我们使用HK-2细胞（人肾小管上皮细胞系）进行了CCK8和划痕实验。
CCK8实验结果显示，与对照组相比，PS暴露24小时显著降低了HK-2细胞活力（图7A, B）。在低浓度（0.1–5 mM）下，PS对细胞活力没有明显影响（活力 > 80%）。当浓度增加至10 mM时，细胞活力开始显著下降（活力 = 72.3 ± 4.1%, *p< 0.05）。在浓度 ≥ 25 mM时，细胞活力被显著抑制（25 mM: 58.6 ± 3.8%, **p< 0.01; 50 mM: 35.2 ± 2.9%, **p< 0.01; 100 mM: 18.7 ± 2.5%, **p< 0.01）。计算得出PS对HK-2细胞的IC50为35.66 mM，证实了PS对肾小管上皮细胞具有浓度依赖性的细胞毒性——这与第3.1节中预测的PS肾毒性一致。
基于IC50结果，我们选择了12.5和25 mM（低于IC50的浓度）通过划痕实验评估PS对HK-2细胞迁移的影响（图7C, D）。在0小时，所有组的划痕宽度均匀。培养24小时后，对照组显示出明显的细胞向划痕区域迁移，划痕间隙几乎被覆盖（愈合率 = 78.2 ± 5.3%）。相比之下，12.5 mM PS组的迁移显著减少，划痕愈合率下降至45.7 ± 4.6%（p< 0.01）。25 mM PS组显示出更明显的抑制作用，划痕愈合率进一步降低至28.3 ± 3.9%（p< 0.01）。这些结果表明，PS以浓度依赖的方式抑制肾小管上皮细胞的迁移，这可能会损害肾组织损伤后的修复过程——为PS诱导的肾功能障碍提供了直接的体外证据。
使用Western Blot检测HK-2细胞中APP蛋白的表达，以GAPDH作为内参。代表性的Western Blot条带显示，APP（87/100-140 KDa）和GAPDH（36 KDa）清晰可见，并且与对照组相比，12.5和25 mM PS组的APP条带强度增加（图7E）。对相对蛋白表达量（APP/GAPDH）的定量分析表明，PS处理组中APP表达呈浓度依赖性上调（图7F），其中25 mM组的APP表达水平最高。
图7. 山梨酸钾对HK-2细胞毒性及APP蛋白表达的影响
（A）不同浓度山梨酸钾处理24小时后HK-2细胞相对活力的柱状图（B）山梨酸钾抑制HK-2细胞活力的剂量反应曲线及IC50计算（C）山梨酸钾处理HK-2细胞0小时和24小时后划痕区域的代表性显微图像（100倍放大）（D）山梨酸钾处理HK-2细胞划痕愈合率的定量分析（E）不同浓度山梨酸钾处理的HK-2细胞中APP和GAPDH的Western blot条带（F）不同浓度山梨酸钾处理的HK-2细胞中APP相对蛋白表达量（APP/GAPDH）的定量分析
讨 论
本研究通过网络毒理学和分子对接方法研究了PS诱导肾损伤的机制。应用网络评估工具后，我们系统利用SwissTargetPrediction、SEA Search、GeneCards、OMIM和TTD数据库筛选出238个与PS诱导肾损伤相关的潜在靶点。利用STRING数据库和细胞景观，我们构建了潜在靶基因的相互作用网络，并识别出10个关键节点，包括MMP9、MMP2、APP、PTGS2和SIRT1。这些靶点与PS表现出强亲和力，代表了PS诱导肾损伤的主要靶标。PS是一种全球广泛使用的食品防腐剂，普通人群通常通过加工食品长期暴露于低剂量PS。临床上，AKI常进展为CKD并增加心血管风险；我们发现的机制（例如PS-MMP9介导的细胞外基质降解，APP驱动的内皮-免疫细胞交互）与临床AKI/CKD的关键病理特征（例如肾小球基底膜损伤，间质炎症）相吻合，这将实验室发现与人类实际面临的PS相关肾脏风险联系起来。
MMP9参与细胞外基质的降解，并与炎症和纤维化相关。PS在体内代谢为山梨酸，可能通过肾脏排泄过程在肾小管上皮细胞（AKI涉及的关键细胞类型）中引起氧化应激。肾脏中活性氧（ROS）浓度升高，触发NF-κB等炎症信号通路，导致MMP9表达升高。MMP9通过降解IV型胶原等基底膜成分，破坏肾小球和肾小管的结构完整性，引起蛋白尿和组织损伤。
MMP2是锌依赖性内肽酶家族的成员，其主要功能与MMP9相似，都是靶向降解关键的细胞外基质成分，并且在组织重塑、炎症反应和纤维化等病理生理过程中不可或缺。MMP2能够切割或激活促炎因子（如IL-1β, TNF-α）和趋化因子，放大炎症信号；同时，它可能通过释放基质结合的生长因子（如VEGF）影响血管通透性和炎症反应。MMP2与TIMPs（组织金属蛋白酶抑制剂，如TIMP2）的比例失衡可能导致ECM合成/降解失衡，加速纤维化进程。
APP是一种跨膜蛋白，在正常生理条件下参与细胞粘附、突触形成和损伤修复。它通过α-分泌酶或β-分泌酶途径被切割，产生不同的片段，其中β-分泌酶途径产生的β-淀粉样蛋白（Aβ）在阿尔茨海默病的大脑中形成淀粉样斑块。PS可能通过调控APP表达诱导肾损伤过程。研究发现Aβ异常积聚在肾小球或肾间质，形成淀粉样物质，这可能进一步破坏滤过屏障，导致蛋白尿和肾功能下降。此外，APP-CD74轴促进了内皮细胞与巨噬细胞之间的通讯，从而加剧肾损伤和纤维化。临床上，在病因不明的CKD患者的肾组织中观察到了异常的APP表达；我们的研究表明PS（一种广泛存在的环境因素）可能与此有关，为研究特发性肾损伤提供了新线索。此外，我们鉴定出的APP-CD74/PTGER2轴可以作为潜在的临床干预靶点，增强了我们研究结果的转化价值。
PTGS2是前列腺素合成过程中的关键限速酶，催化花生四烯酸生成前列腺素，在炎症、血管调节和细胞保护中发挥重要作用。在缺血/再灌注和脓毒症等AKI模型中，炎症因子（如TNF-α, IL-1β）诱导PTGS2高表达，促进PGE2产生并放大炎症反应（如巨噬细胞浸润和ROS产生）。
SIRT1是sirtuin家族的成员，主要参与细胞应激反应、能量代谢、抗氧化等过程，并与衰老和各种疾病相关。SIRT1通过去乙酰化FoxO和PGC-1α等蛋白，激活抗氧化途径（如SOD, CAT, GSH-Px），减少ROS的积累。过量的PS可能抑制SIRT1的表达或活性，导致抗氧化能力下降、ROS过度积累以及肾小管上皮细胞的氧化损伤。SIRT1通过去乙酰化抑制NF-κB p65亚基的转录活性，减少促炎因子（如TNF-α, IL-6, IL-1β）的释放。抑制SIRT1会导致NF-κB过度活化，促进肾脏局部炎症反应，加重肾组织损伤。SIRT1可能抑制TGF-β信号传导，减少Smad3乙酰化和胶原沉积，延缓肾纤维化。SIRT1活性降低可能激活TGF-β/SMAD3通路，促进细胞外基质（ECM）沉积，导致肾间质纤维化。
根据KEGG通路富集分析结果，PS可能通过"Pathways in cancer"、"Lipid and atherosclerosis"、"Prostate cancer"以及"AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications"等通路诱导肾损伤。
近年来，多项研究揭示了肾癌与肾损伤之间的密切关联。作为肾癌的常见并发症之一，肾损伤的机制与抗肿瘤药物的肾毒性密切相关。PS可能通过多种途径诱导肾损伤，其作用机制类似于抗肿瘤药物的肾毒性。在分子水平上，PS可能干扰血管内皮生长因子及其相关受体的正常功能，导致肾脏血管发生病理改变，进而影响肾脏血液供应，最终导致肾损伤。此外，PS的代谢过程产生大量ROS，并在肾小球中积累，不仅破坏肾小球的结构完整性，还影响其正常生理功能，导致肾小球疾病的发生和发展。临床上，患者可能表现为蛋白尿和血尿等典型症状，严重者可导致肾损伤。
在PS的代谢过程中，它可能打破细胞内的氧化还原稳态，促进ROS的异常积累。过量的ROS可引起肾细胞发生一系列病理变化，如三磷酸腺苷耗竭、脂质过氧化、蛋白质变性和DNA损伤。这些分子水平的损伤可激活炎症级联反应，促进巨噬细胞浸润并吞噬氧化修饰的脂质，最终转化为动脉粥样硬化斑块的核心成分——泡沫细胞。值得注意的是，动脉粥样硬化与肾损伤之间存在双向病理关联，尤其在CKD患者中，两者形成恶性循环。一方面，CKD特有的脂蛋白代谢紊乱（如致动脉粥样硬化脂蛋白表型）加速斑块形成；另一方面，血管硬化引起的肾脏灌注不足以及游离脂肪酸的积累，可通过诱导线粒体膜去极化、促进内质网应激等机制加剧肾小管上皮细胞凋亡，并激活TGF-β/SMAD3等关键信号通路，持续驱动肾脏的炎症反应和纤维化进程。
最近的研究表明，PS可能通过前列腺癌相关信号通路参与肾损伤发生和发展的机制。在分子机制层面，PS代谢过程中产生的ROS不仅可诱导类似于前列腺癌特征的氧化应激反应，还能激活NF-κB信号级联，诱导IL-6和TNF-α等炎症因子的表达，驱动炎症细胞浸润至肾间质。这种持续的炎症微环境促进细胞外基质重塑，最终导致不可逆的肾间质纤维化。值得注意的是，在病理演变过程中，PS还能调控COX-2/PGE2通路，导致前列腺素代谢失衡。这种失衡状态不仅加剧了现有的炎症级联，还可能通过正反馈机制促进下游信号分子（如PGE2受体EP4）的异常激活，形成促纤维化恶性循环，从而恶化肾脏病理过程。
在与糖尿病相关的病理生理机制中，晚期糖基化终末产物（AGEs）作为持续性高血糖的特征性代谢产物，通过与其特异性受体RAGE结合介导关键信号转导事件。PS可能通过诱导氧化损伤和炎症反应参与该通路的调控。尤其值得注意的是，既往研究已阐明AGEs-RAGE信号轴在糖尿病肾病的进展中起核心调控作用，并且该通路可通过上调TGF-β1的表达加重疾病进程；进一步研究表明，在糖尿病肾病的微环境中，TGF-β1作为关键的促纤维化因子，通过诱导肾小球系膜细胞中细胞外基质的病理性积聚，驱动进行性肾间质纤维化的发展，最终导致肾脏结构重塑和进行性功能恶化。上述分子事件级联系统地阐明了糖尿病肾损伤的核心病理机制。
结 论
本研究综合利用网络毒理学、分子对接、机器学习和单细胞分析，全面阐明了山梨酸钾（PS） 诱导急性肾损伤（AKI） 的分子机制。研究发现，PS可通过氧化应激和炎症反应等关键病理过程，直接与MMP9和APP等核心靶标相互作用。此外，PS通过调节脂质代谢紊乱和AGE-RAGE信号通路，导致肾细胞代谢功能障碍和微环境紊乱，从而引发AKI。本研究创新性地发现并确定APP是一个核心中介因子。这一发现为理解PS诱导的AKI提供了全新的细胞生物学视角。本研究不仅加深了我们对食品添加剂肾毒性的理解，而且为探索AKI的分子机制和早期预警信号建立了新的理论基础和研究方法。
方 法
动物样本采集
PS毒性初步分析
通过整合基于网络的搜索算法和生物毒性预测方法，可以在合适的软件工具中使用结构模型预测PS相关毒性。具体而言，采用ProTox-3.0作为初步筛选工具，以获取有关PS毒性的准确数据。本研究的技术路线图如图1所示。
PS靶点收集
通过在PubChem数据库中搜索"Potassium sorbate"，获得PS的标准结构和"SMILE"（一种表示化合物化学结构的字符串符号）。根据关键词"Potassium sorbate"的搜索结果，从SwissTargetPrediction、SEA Search Server和Super-PRED等数据库收集PS的潜在靶点，并将物种范围限定为"智人"。所有靶点概率值均高于0.1。最终，我们对先前获取的靶点进行整合与去重，创建了一个PS靶点库。
肾损伤相关靶点网络的选择
以"kidney injury"为关键词，使用Drugbank、GeneCards和OMIM数据库查找相关靶点。为确保所识别基因与肾损伤的强关联性，我们对GeneCards数据库的数据进行了进一步分析，将"评分"标准设定为中位数，并选取"评分"值超过中位数的基因来构建肾损伤靶点网络。由于Drugbank和OMIM数据库不提供"评分"值且包含靶点数量较少，因此未对这些数据做进一步处理。此外，我们筛选了PS靶点与肾损伤靶点之间共有的潜在靶点，将其交集确定为PS诱导肾损伤的潜在靶点，并使用SRPLOT平台对这些靶点进行可视化。
蛋白质相互作用网络构建与核心靶点筛选
将PS诱导肾损伤的潜在靶点基因输入STRING数据库。通过将物种限定为"智人"，将"最小所需相互作用评分"设置为"高置信度 > 0.7"，并配置"FDR严格性"为"0.7"，使用STRING数据库对PS诱导肾损伤的潜在靶点进行分析。这些参数确保我们分析与靶点基因对应的活性靶标蛋白。
随后将STRING生成的结果加载到网络生物学可视化软件Cytoscape 3.10.2中。Cytoscape 3.10.2计算网络图中每个节点的参数并可视化分子间的互连关系。这使得能够计算网络节点和边的拓扑特性，从而构建了一个包含236个节点和3583条边的初始蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。"度"指的是特定蛋白质与其他蛋白质相互作用的数量，通常用于衡量该蛋白质在网络中的重要性和中心性。具有高度值的蛋白质通常被视为网络中的关键节点，并可能对生物过程产生重要影响。我们使用"MCODE"（分子复合物检测）功能识别PPI网络中的关键子网络或模块，每个PPI模块代表一个功能相关的基因簇，具有不同的模块评分，便于根据这些评分选择关键基因。我们首先基于度值可视化蛋白质网络，然后通过Cytoscape 3.10.2的MCODE插件对PPI网络中的每个靶点进行评分，并选择得分最高的簇进行可视化。最后，我们选取了MCODE评分前21的靶点与度值前21的靶点的交集，得到10个核心靶点，并通过SRPLOT平台进行可视化。
基因本体论分析和京都基因与基因组百科全书分析
为研究PS诱导肾损伤相关潜在靶点的生物学功能，从DAVID数据库获取数据，随后进行GO分析和KEGG通路富集分析。我们进行了GO分析，涵盖生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）的评估，以阐明其主要生物学功能。此外，进行KEGG富集分析以揭示与PS和肾损伤潜在靶点相关的重要通路，使用p值小于0.05的阈值来确定所识别靶点的主要毒性通路。我们使用DAVID数据库对238个潜在靶点进行了GO富集分析，将物种限定为"智人"。分析获得了1032个具有统计学意义的GO条目，包括687个BP、106个CC和239个MF。根据GO富集分析结果，我们在SRPLOT平台上使用不同的横轴对它们进行了可视化。KEGG富集分析结果基于p值小于或等于0.05，获得了176条信号通路。按p值排序的前20个基因和按Count值排序的前10个基因在SRPLOT平台上进行了可视化。
PS与核心靶点的分子对接
首先，我们在PubChem数据库中搜索PS并导出其"SDF"结构。接下来，从RCSB (https://www.rcsb.org/) 和Uniprot (https://www.uniprot.org/) 获取核心蛋白的3D结构。随后，使用Autodock软件（1.5.6）进行脱水和电荷编辑，并将修饰后的靶蛋白和关键化合物导出为PDBqt文件。然后，使用Autodock Vina（1.2.x）软件进行分子对接。最后，将对接结果导入PyMOL软件（3.1.0）进行分析和可视化。
分子动力学模拟
本研究使用Gromacs 2022进行分子动力学模拟。力场参数通过Gromacs的pdb2gmx工具和AutoFF网页获取。在模拟过程中，受体蛋白的分子参数使用Amber14sb力场建模，而配体的分子参数使用GAFF2力场建模。在系统周围添加了一个半径为1 nm的TIP3P立方水盒进行溶剂化。使用gmx genion工具向系统中添加离子以实现电中性。使用粒子网格Ewald（PME）方法处理长程静电相互作用，截断距离设置为1 nm。所有键约束均使用SHAKE算法完成，分子动力学模拟的积分时间步长使用Verlet leapfrog算法设置为1 fs。在进行分子动力学模拟之前，系统进行了能量优化。能量最小化过程包括3000步最陡下降优化，随后进行2000步共轭梯度优化。优化步骤如下：首先约束溶质并最小化水分子；接下来约束抗衡离子并进行最小化；最后在无约束条件下最小化整个系统。模拟在NPT条件下运行，温度为310 K并保持恒压，模拟时间为100 ns。在模拟过程中，使用g-rmsd、g-rmsf、g-hbond、g-Rg和g-sasa工具计算均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、氢键（HBonds）、回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）以及吉布斯自由能；使用GROMACS中的g_mmplosa包计算复合物的MM-PBSA结合自由能。
机器学习
从3个数据库下载了3个数据集：GTEx（肾皮质）、KPMP（11个AKI和16个CKD）和GEO（GSE61739）。使用Combat方法进行归一化，PCA图显示了批次效应去除的结果。机器学习模型包括：随机森林（RF）、支持向量机（SVM）、梯度提升机（GBM）、K近邻（KNN）、最小绝对收缩和选择算子（LASSO）以及决策树（DT）。每个模型输出前30个重要基因。ROC曲线验证每个模型的准确性，并选择最准确的模型结果与先前分析得到的10个关键基因取交集。
单细胞分析
从肾脏精准医学项目（KPMP）数据库（https://www.kpmp.org/）下载2个单细胞RNA测序（scRNA-Seq）数据集（患者编号：28-12619, 933-10155）。使用SingleCellAnalysis网站（https://www.singlecellanalysis.org/）进行单细胞分析。首先，进行质量控制，参数设置为：下限20，上限2500，去除线粒体基因百分比为20%。然后，进行数据整合，结果呈现在UMAP图中。接着，进行自动细胞注释，结果展示在UMAP图中。随后，进行细胞-细胞通讯分析，选择connectome作为分析方法，并选择Consensus作为知识资源。在细胞-细胞通讯分析结果中，搜索机器学习得到的基因，并确保结果足够合理，筛选标准为weight_sc大于1。
体外实验
人肾小管上皮细胞（HK-2细胞系）购自Procell Life Science & Technology Co. Ltd。细胞在MEM培养基（Gibco）中培养，培养基中添加了10%胎牛血清（FBS, Gibco）和1%青霉素-链霉素（Solarbio, China），培养环境为37°C、5% CO₂的湿润气氛。山梨酸钾（PS, 纯度 ≥ 99%, Sigma-Aldrich）溶解在完全培养基中制备成100 mM储备液，并通过0.22 μm滤膜过滤除菌。通过将储备液用完全培养基进行系列稀释，制备PS的工作浓度（0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 12.5, 25, 50, 和 100 mM）。Cell Counting Kit-8（CCK8）购自Beyotime Biotechnology。
取对数生长期的HK-2细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA（Solarbio）消化，用完全培养基重悬，并使用血球计数板计数。将细胞以每孔5 × 10³个细胞的密度（每孔100 µL）接种到96孔板中，培养24小时使细胞贴壁。贴壁后，吸弃培养基，每孔加入100 µL PS工作液（不同浓度）或完全培养基（对照组）。每个浓度组和对照组均设5个生物学重复。孵育24小时后，每孔加入10 µL CCK8试剂，并在37°C下继续孵育2小时。使用酶标仪（Thermo Fisher Scientific, USA）测量450 nm处的吸光度。细胞活力计算公式如下：细胞活力（%）=（处理组吸光度 - 空白组吸光度）/（对照组吸光度 - 空白组吸光度）× 100%。使用GraphPad Prism 9.0软件（GraphPad Software）通过四参数逻辑回归模型计算PS对HK-2细胞的半数抑制浓度（IC50）。
将HK-2细胞以每孔2.5 × 10⁵个细胞的密度接种于12孔板中，培养至细胞融合度 > 80%。使用无菌200 µL移液器吸头在细胞单层上划一条直线划痕（确保所有孔的划痕宽度一致）。用磷酸盐缓冲盐水（PBS, Solarbio）洗涤三次以去除脱落的细胞，然后每孔加入1 mL完全培养基（对照组）或PS工作液（12.5 和 25 mM，根据IC50结果选择以避免过度细胞毒性）。每组设三个生物学重复。将培养板放回培养箱，并在0小时和24小时使用倒置显微镜（Olympus）在100倍放大倍数下拍摄划痕区域图像。使用ImageJ软件（NIH, USA）量化划痕面积，并按以下公式计算划痕愈合率：划痕愈合率（%）= [（0小时划痕面积 - 24小时划痕面积）/ 0小时划痕面积] × 100%。
对于蛋白提取，将蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂按体积比100:1:1加入RIPA裂解缓冲液中并充分混匀。将6孔板中的HK-2细胞用预冷的PBS洗涤两次，使用制备好的RIPA裂解缓冲液刮取并收集细胞至离心管中，然后在冰上孵育30分钟。裂解物在4°C下以12,000 x g离心10分钟，将上清液转移至新管中。取一小部分使用96孔板法进行BCA蛋白定量（BCA工作液按A:B = 50:1制备，生成标准曲线，并在562 nm处测量吸光度），而剩余上清液与5 × SDS上样缓冲液混合，并在100°C下变性10分钟。对于Western blot，使用改良的凝固剂制备分离胶和浓缩胶的聚丙烯酰胺凝胶。上样样品（5 µg蛋白）和蛋白marker，随后进行电泳：浓缩胶80 V 30分钟，分离胶120 V 1.5小时。PVDF膜在甲醇中激活15分钟，并在280 mA条件下转膜2小时。膜在室温下用5% BSA封闭2小时，然后在4°C下与一抗（APP和GAPDH, 1:500）孵育过夜，随后在37°C下与HRP标记的二抗（1:1000）孵育2小时。最后，使用ECL试剂检测条带。
统计分析
所有体外实验数据均以平均值 ± 标准差（SD）表示。组间统计学差异采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验进行分析。p值 < 0.05被认为具有统计学显著性（*p < 0.05, **p < 0.01）。
代码和数据可用性：
如需获取数据，可向作者提出请求。
引文格式：
Yimao Wu, Yalun Liang, Jintao Liang, Gokhan Zengin, Qian Zhang, Meng-Yao Li. 2025. "Potassium Sorbate Triggers Kidney Injury via Dysregulated Intercellular Communication: A Study Combining Network Toxicology, Machine Learning, Molecular Docking, and Single-Cell RNA Sequencing."iMetaMed: e70017. https://doi.org/10.1002/imm3.70017.
作者简介
Gokhan Zengin（通讯作者）
● 塞尔库克大学理学院生物系教授。
● 其主要研究方向集中于化学特性分析、天然产物生物活性以及创新且可持续的提取与加工技术。研究成果已通过800余篇经同行评审的科学论文发表，同时发表了数量相当的会议报告，并在众多科学与工业会议上作专题发言；此外，他还出版了4部专著及10个学术章节。
张谦（通讯作者）
● 副研究员，国家自然科学基金函评专家，硕士研究生导师。
● 研究方向：（1）传统中药/药食同源中药抗炎与免疫药理；（2）益生菌与人体健康效应机制研究。主持包括主持国家自然科学基金在内的项目共计17项；发表论文30余篇。任iMeta期刊及多个国际期刊青年编委。
李梦尧（通讯作者）
● 上海交通大学医学院附属仁济医院/上海市肿瘤研究所助理教授。
● 主要研究方向为药食同源资源开发、药食同源抗肿瘤活性及机制研究、肿瘤低毒治疗、抗肿瘤活性化合物合成及应用等领域开展研究。任Cancer Drug Resistance、Innovation、Exploration、iMeta、Interdisciplinary Medicine、Medicine Advance等数十本期刊副主编、编委。
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iMeta封面
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期刊简介
“iMeta” 是由威立、宏科学和本领域数千名华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等前沿交叉学科。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括中英双语图文、双语视频、可重复分析、图片打磨、60万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊！相继被Google Scholar、PubMed、SCIE、ESI、DOAJ、Scopus等数据库收录！2025年6月影响因子33.2，中科院分区生物学1区Top，位列全球SCI期刊前千分之三(65/22249)，微生物学科2/163，仅低于Nature Reviews，学科研究类期刊全球第一，中国大陆5/585！
“iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，目标是成为影响因子大于10的高水平综合期刊，欢迎投稿！
"iMetaMed" 是“iMeta” 子刊，专注于医学、健康和生物技术领域，目标是成为影响因子大于15的医学综合类期刊，欢迎投稿！
iMeta主页：
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姊妹刊iMetaOmics主页：
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