在ChIP-seq实验中，染色质的交联固定是捕获蛋白-DNA相互作用的“第一道防线”，直接决定后续免疫沉淀、测序结果的真实性与可靠性。若交联不充分，瞬时结合的蛋白-DNA复合物可能会解离，导致假阴性；若交联过度，不仅增加超声破碎难度，还可能掩盖抗原表位、引入非特异性结合，干扰实验结果。
一、交联固定的核心原理：“冻结”真实的相互作用
ChIP-seq的核心是在体内环境下捕获蛋白质与DNA的结合状态，而交联固定的本质的是在蛋白与DNA、蛋白与蛋白之间形成共价键，“冻结”它们的相互作用，防止后续样本处理（裂解、超声等）过程中复合物解离或结构重排。
目前ChIP-seq实验中最常用的是甲醛交联法，甲醛作为双功能小分子试剂，能快速穿透细胞膜和核膜，通过醛基在DNA碱基的氨基/亚氨基与蛋白质碱性氨基酸的氨基之间形成可逆的亚甲基桥，实现高效交联。
二、细胞样本的交联固定步骤
1. 显微镜下观察细胞，确定生长状态良好且无污染，在细胞密度生长至约为90%的汇合度时收样；
2. 弃掉旧培养基，加入适量新鲜培养基，37℃培养30 min；
3. 交联前准备：配制含蛋白酶抑制剂的PBS溶液（以下简称PBS），充分混匀，冰上放置；【选做】
4. 交联：在20 mL培养基中加入560 uL 37%的甲醛溶液，使其终浓度达到1%，轻轻转动培养皿混匀，室温缓慢摇动10 min（具体加入甲醛量可以根据培养基体积做调整，最终浓度1%条件下进行交联）；【选做】
5. 终止交联：向培养皿中加入1.37 mL 2 M甘氨酸溶液，混匀后室温摇动5 min终止交联（甘氨酸终浓度为0.125 M）；【选做】
6. 清洗：弃去培养基，用预冷的PBS溶液漂洗两次，注意保持贴壁细胞贴壁，不要晃动细胞；
7. 收集细胞：更换新的预冷PBS溶液，对于贴壁细胞用细胞刮将细胞轻柔刮下并计数，计数后分装，准确标记后将分装好的细胞离心收集沉淀细胞（建议不使用胰酶处理贴壁细胞，避免影响细胞状态），对于悬浮细胞收集细胞后分装离心；
8. 冻存：
——直接冷冻：弃尽上清，液氮速冻，-80℃保存，送样时选择干冰运输寄送。【交联后可选择直接冷冻】
——程序性降温：尽量彻底地移除上清，加入1 mL预冷的细胞冻存液，轻轻吹打细胞沉淀混匀，慢速降温冻存（冻存常用方法：4℃ 10 min→ -20℃ 30 min→ -80℃ 16～18 h（过夜）→（液氮）；【如送公司交联且需扩培细胞可考虑冻存】
9. 将冻存管置于密封性好的塑料袋中，用胶布缠到冰袋上，并在泡沫盒中装入足量的干冰进行运输；
10. 为确保实验的顺利，建议样品备份1-2份，以防备部分样品降解重新取材、 制备或送样，耽误时间。
——注：
（1）若交联后送样检测WB，需单独分装约10 μL干体积样本，该样本无需交联，经PBS清洗后收集细胞沉淀，液氮速冻后干冰邮寄（交联会遮蔽抗原表位，影响WB检测结果）。
（2）如需送样，交联试剂可联系我司区域销售经理申领。
（3）组织样本需在真空环境下交联，操作难度较高，建议直接寄送我司处理，确保交联效果。
