大鼠背根神经节神经元（DRG）原代细胞的分离
背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)又称脊神经节，为脊神经发出区域的膨大部分，节内包裹着大量呈卵圆形的假单极神经元胞体，是外周神经系统的重要组成部分。DRG内神经元胞体的大小不一，小的着色较深，主要为温度敏感型神经元；大的着色较浅，主要为痛觉和触觉神经元。DRG神经元不仅分泌多种肽类神经递质和氨基酸类神经递质，细胞膜上也表达多种钠、钙等离子通道，这些物质在温度感受、痛觉传递等生理功能上起着重要的作用。DRG神经元的培养已成为神经源性炎症、疼痛治疗以及体温感受与调节等方面研究的必不可少的手段。
二、材料：
1、实验动物：3W以上SD大鼠5只（雌雄不限）
2、组织来源：背根神经节
3、手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）、手术刀
4、消化酶：Ⅱ型胶原酶
5、培养基：DMEM+10%FBS+1%双抗
6、包被条件：0.1mg/ml的多聚赖氨酸
三、实验步骤
1. 培养瓶的包被：将浓度为0.1mg/ml的多聚赖氨酸加入6孔板中，以覆盖培养板底部为准，37℃培养箱内放置2h或4℃包被过夜，临用前用PBS清洗3次，于超净台中晾干备用。
2. 颈椎脱臼法处死大鼠后置于75%酒精，浸泡5min。
3. 迅速剪下脊柱，尽可能剔除多余肌肉，对半剪开脊柱，轻轻拨出脊髓，从椎孔里扯出背根神经节，用含2%双抗的PBS漂洗2次。
4. 在解剖镜下将膨大部分剪出，仔细修剪背根神经节。
5. 取回放入超净台，PBS漂洗分离后的背根神经节，用眼科剪将背根神经节剪成1 mm³左右的组织块。
6. 加入1ml的0.5%Ⅱ型胶原酶，在37℃的培养箱里消化30min，每5min观察消化情况，并用移液枪轻轻吹打数次（具体消化时间根据实际消化情况来定）。
7. 用含10%FBS的DMEM培养液终止消化，收集上清，200目筛网过滤，用15ml离心管收集细胞，1000rpm/min离心5min，弃上清液，加入含10%FBS的DMEM培养基重悬，轻轻吹打，将细胞均匀分布于T25培养瓶中。
8. 3d后镜下观察并更换培养基继续培养，待细胞密度达到80-90%左右时，可进行冻存。
四、实验过程图片
图1 取出大鼠的脊柱
图2 纵向剖开脊柱暴露出大鼠背根神经节
图3 取出背根神经节并仔细修剪
图4 剪碎消化过程
五、各阶段的背根神经节神经元细胞照片（白光）
图5 原代培养第1天铺板
图6 原代培养第4天
六、大鼠背根神经节神经元荧光鉴定
鉴定方法：Tubulin Beta及MAP2特异性抗体免疫荧光鉴定
Figure 1 Figure 2
Figure 1 Immunofluorescence identification of Tubulin Beta specific antibody (×200)
Figure 2 Immunofluorescence identification of Tubulin Beta specific antibody (×400)
Figure 3
Figure 3 Immunofluorescence identification of MAP2 specific antibody (×200)
备注：
1、该细胞形态为神经元细胞样，属于终末分化细胞，不增殖的细胞群。
2、此protocol适用于小鼠、犬等物种。
3、有技术问题请联系武汉云克隆
