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1.引言
糖尿病已成为当代最严重和最常见的慢性疾病之一。截至2021年，估计全球20-79岁人群的糖尿病患病率为10.5%。糖尿病以持续性高血糖为特征，导致多器官并发症，给医疗系统带来重大挑战。糖尿病膀胱功能障碍是一种常见的泌尿系统并发症，影响超过50%的长期血糖控制不佳的糖尿病患者。其特征为膀胱感觉受损、容量增加、收缩力降低以及残余尿量增多。
由于糖尿病人群的异质性，在人类中研究糖尿病膀胱功能障碍具有挑战性。传统上，糖尿病膀胱功能障碍被认为是一个两步过程。最初，膀胱肥厚和收缩力增强作为对多尿的代偿性反应发生。第二阶段涉及失代偿，归因于毒性代谢产物积累、氧化应激和其他机制引起的神经和肌肉损伤。链脲佐菌素常用于诱导大鼠糖尿病模型，失代偿期通常在注射链脲佐菌素后9至12周出现。排尿涉及下尿路平滑肌和横纹肌的协调活动，由跨越大脑、脊髓和外周神经节的复杂神经网络调控。鉴于这些机制的复杂性，排尿极易受到损伤、疾病和神经毒性化学物质的影响。糖尿病膀胱功能障碍的治疗是泌尿外科领域的一大挑战。在此研究先前的研究中，发现5-HT₁A受体激动剂可能作用于L6-S1脊髓背外侧核的受体，促进周期性尿道外括约肌活动并增强尿道松弛，从而改善糖尿病膀胱功能障碍大鼠的排尿效率。然而，这些相关药物是否对大脑产生影响仍不清楚。
功能磁共振成像是一种利用血氧水平依赖效应研究中枢神经系统功能的无创技术。它可以绘制任务诱发的脑活动图，或探究静息状态下的自发性低频信号波动。静息态功能磁共振成像采用低频振幅和功能连接等指标：低频振幅量化与脑区神经活动水平相关的自发性神经活动变化，而功能连接评估脑区间信号相关性。这些指标有助于刻画脑生理和病理改变。任务态功能磁共振成像已用于评估其他下尿路疾病排尿期间的脑区激活。然而，既往关于糖尿病膀胱功能障碍的研究主要集中在周围神经系统，对中枢神经系统变化知之甚少。
在此研究中，采用9.4特斯拉功能磁共振成像探究12周糖尿病大鼠模型中低频振幅和功能连接的改变。随后，此研究将脑激活模式与膀胱测压技术相关联，以检查糖尿病大鼠脑信号的变化。此外，此研究进一步探索了给予5-HT₁A受体激动剂后诱导的脑改变。
2.材料与方法
2.1.动物准备
此研究使用40只雄性Sprague-Dawley大鼠，8周龄，体重280-320g。将它们随机分为两组：年龄匹配的正常对照组和链脲佐菌素诱导的糖尿病组，每组20只。禁食18小时后，通过单次腹腔注射溶于0.1 M柠檬酸盐缓冲液的65 mg/kg链脲佐菌素诱导糖尿病。正常对照组大鼠接受等体积的柠檬酸盐缓冲液。注射链脲佐菌素后72小时测量血糖水平高于300 mg/dL的大鼠被视为糖尿病。所有大鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环中，可自由进食。3只糖尿病大鼠因感染被排除。实验在注射后12周进行。正常对照组15只大鼠和糖尿病组14只大鼠用于膀胱内记录和磁共振成像测量，每组3只大鼠分配用于组织学分析。整个程序经上海市第六人民医院动物护理和使用委员会批准，符合机构动物护理政策。
2.2.药物
链脲佐菌素(STZ; Sigma-Aldrich) 溶于0.1 M柠檬酸盐缓冲液（pH4.5）。高选择性5-HT₁A受体激动剂NLX-112盐酸盐(Sigma-Aldrich; pK = 9)溶于二甲基亚砜(DMSO) ，并用蒸馏水进一步稀释。
2.3.膀胱测压方法
膀胱测压按先前描述的方法进行。大鼠经乌拉坦麻醉，在此麻醉下神经活动模式与清醒状态相对相似(1.2 g/kg s.c.) 。该剂量提供了持久的麻醉效果，无需补充，该方案在先前的研究中已验证可维持稳定的生理参数和完整的膀胱反射。将聚乙烯导管 (PE-50; Becton Dickinson) 插入左侧颈静脉用于药物输注。通过腹部正中切口进入膀胱，将末端扩口的聚乙烯导管（PE-90；Becton Dickinson）插入膀胱顶部并用缝线固定。导管外端通过三通阀连接至微输注泵(LD-P2020 II; Lande Medical Instrument)和压力传感器(AD Instruments) ，用于监测膀胱内压 (IVP) 。麻醉给药后90-120分钟，在确认呼吸频率(65-75 呼吸/分钟) 和核心体温(经直肠探头测量为37.0℃±0.3℃) 稳定后开始功能磁共振成像扫描。
2.4.膀胱测压联合功能磁共振成像方案
将室温生理盐水注入膀胱以诱发重复排尿反应。对照组大鼠的输注速率为0.2 mL/min，糖尿病模型大鼠为0.8 mL/min（后者因膀胱扩张所致），确保每次MRI测量前8分钟20秒内产生足够的排尿收缩。膀胱容量通过首次收缩间期乘以输注速率计算得出。实验大鼠置于9.4特斯拉动物MRI扫描仪（Bruker BioSpec 94/30 USR）内，配备恒温垫（37.8°C）和呼吸频率监测仪（SA instruments）。采用3×1接收器阵列（Bruker）以提高检测灵敏度。通过定位扫描确定动物位置后，使用梯度回波平面成像（EPI）序列（T2加权）进行血氧水平依赖性（BOLD）功能磁共振成像，参数如下：重复时间（TR）=2000毫秒；回波时间（TE）=16.195毫秒；翻转角=90°；矩阵尺寸=128×96；视野范围（FOV）=3.5×3.5平方厘米（35×35平方毫米）；层数=25；层厚=0.7毫米；平面内体素尺寸= FOV /矩阵尺寸=0.27×0.36平方毫米（35毫米/128×35毫米/96）；原始体素总尺寸=0.27×0.36×0.7立方毫米；总扫描时间：8分钟20秒。T2加权结构图像亦采用快速采集与弛豫增强（RARE）序列获取，参数如下：TR=2500毫秒；TE=34毫秒；翻转角=180°；矩阵尺寸=256×256；视野范围=3.5×3.5平方厘米；层数=25；层厚=0.7毫米；总扫描时间：2分钟。
图1反射性排尿期间功能性磁共振成像的实验方法。
首先获取解剖图像（T2RARE序列）以辅助解剖定位及功能图像配准。随后如图1a所示，每只大鼠分别进行两次膀胱空状态MRI扫描和两次膀胱充盈状态扫描。注射 NLX -112（0.3 g/kg）后，每组五只大鼠均进行两次给药后MRI扫描。
预处理步骤包括：将体素尺寸缩放10倍、去除前10个容积数据以适应大鼠对扫描仪的适应性、执行层间时间校正、进行头部运动校正重定位、基于标准大鼠脑图谱（SIGMA模板）进行标准化处理，以及采用各向同性高斯核（半高全宽 FWHM 8mm）进行平滑处理。若头部运动在x、y或z轴方向位移超过1.0mm或绕任一轴旋转超过2.0°则剔除数据。为进一步降低运动影响，从每个体素的时间序列中回归出平移和旋转产生的六种运动信号。
2.5.静息态功能磁共振成像分析
共有15只正常对照大鼠和14只糖尿病大鼠在连续膀胱测压期间接受了血氧水平依赖功能磁共振成像；然而，由于运动伪影，3只正常对照大鼠和2只糖尿病大鼠被剔除。最终，12只正常对照大鼠和12只糖尿病大鼠被纳入静息态功能磁共振成像的比较分析。使用SPM12和DPARSF在MATLAB R2014b上进行功能磁共振成像数据预处理。然后应用0.01-0.1Hz带通滤波器。对每只大鼠逐体素计算低频振幅。为了比较两组之间的低频振幅值，对每个体素进行t检验。使用FDR校正多重比较以控制假阳性。根据校正后的p值和团块大小阈值识别显著的体素和脑区。结果可视化为统计图，突出显示两组之间低频振幅存在显著差异的脑区。使用两组间低频振幅存在差异的脑区作为种子点，计算其与全脑的相关性。使用皮尔逊相关系数，逐只大鼠计算功能连接图。使用非配对t检验探究正常对照组和糖尿病组之间功能连接的差异。体素水平阈值为FDR校正后p < 0.001，团块阈值为10个连续体素，被认为具有统计学显著性。
基于感兴趣区的功能连接对每只大鼠进行计算。研究选取了7个在 ALFF 上存在差异或与下尿路相关的感兴趣区（ROI），并依据SIGMA图谱进行划分，包括初级运动皮层（M1）、次级运动皮层（M2）、初级体感皮层（S1）、次级体感皮层（S2）、丘脑（Tha）、下丘脑（Hypo）以及导水管周围灰质（PAG）。计算这些脑区两两之间的皮尔逊相关系数。结果以连接矩阵形式呈现。使用非配对t检验比较两组之间的功能连接矩阵。使用FDR进行多重比较校正。由于没有连接对在校正后存活，此研究改为以未校正p值连同两组的平均功能连接矩阵一起呈现结果。
2.6.任务态功能磁共振成像分析
如图1b所示，膀胱收缩期被定义为任务状态，储尿期被定义为静息状态。由于磁共振成像与尿动力学设备之间的高度差以及管路阻力，当灌注泵从非灌注切换到灌注时，压力传感器检测到瞬时压力变化。由于大鼠膀胱颈部未结扎，非收缩期间的膀胱内压是自然充盈期压力。这些数据被纳入静息态功能磁共振成像分析以增加数据集大小。
如前所述，每组纳入12只大鼠进行分析。采用SPM12软件对每只大鼠进行单次任务功能磁共振成像（fMRI）扫描数据的一级分析（每组n=7）。通过广义线性模型（GLM）评估膀胱收缩效应，使用SPM12中的GLM分析功能MRI数据以表征与膀胱压力变化相关的脑活动特征。预处理步骤与静息态功能磁共振成像（rs-fMRI）相同：同步膀胱压力信号经重采样至TR间隔（2000 ms）、低通滤波（0.01-0.1 Hz），并作为连续回归变量与典型血流动力学响应函数（HRF ；双伽马函数，峰值出现在6秒，12秒时出现下冲）卷积后整合至GLM设计矩阵。运动参数及脑脊液/白质信号作为干扰协变量纳入以消除伪影。采用单样本t检验进行体素水平统计分析，多重比较校正（FDR p<0.05）用于界定激活团块。组间差异通过混合效应二级分析评估（T>3.93）。此外，给药前后膀胱收缩期的比较方法相同（每组n=5）。
2.7.组织学分析
大鼠采用戊巴比妥过量注射（100 mg/kg；Sigma公司，美国）实施安乐死。每组（NC组和DM组）各选取3只大鼠，经心脏灌注4%多聚甲醛后完整切除膀胱。组织样本经10%中性缓冲福尔马林固定后石蜡包埋，使用石蜡切片机（RM2016；Leica）制备4 μm 横切片并固定于包被载玻片上。对每只NC组和DM组大鼠膀胱及尿道组织每隔10片切片分别进行苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色及天狼星红染色。采用常规光学荧光显微镜（Nikon Eclipse Ti-SR；尼康公司，日本东京）观察膀胱结构，并通过数码相机（Nikon DS-U3）采集图像。H&E染色图像用于测量组织总厚度及肌层厚度；Masson三色染色图像分析结缔组织面积、总面积及肌层面积；天狼星红染色图像在偏振光显微镜下观察，测定总胶原面积及I型、III型胶原含量。组织面积测量采用ImageJ 1.46软件（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州）。
2.8.统计分析
对于小样本量数据，采用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性。当数据集符合正态性假设（p > 0.05）时，组间比较采用非配对t检验（结果以均值±标准差表示）。非正态分布数据通过Mann-Whitney U检验进行分析，结果以中位数[四分位距]呈现。统计学显著性定义为p < 0.05。数据分析与图表绘制使用GraphPad Prism软件（版本8.0.2）完成。
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3.结果
3.1.正常对照组与糖尿病组的一般及组织学特征
如表1所示，诱导后12周，糖尿病大鼠的体重较正常对照大鼠显著降低。此外，糖尿病大鼠的血清葡萄糖水平显著升高。糖尿病大鼠还表现出显著更大的膀胱质量和容量。然而，两组之间的膀胱肌层厚度或肌层内结缔组织面积比无显著差异。值得注意的是，糖尿病组的III型/I型胶原比值高于正常对照组（图2）。
图2正常对照组（NC）大鼠（A、D、G）与12周糖尿病（DM）大鼠（B、E、H）膀胱组织的组织学分析。
3.2.糖尿病大鼠的静息态功能磁共振成像
采用静息态功能磁共振成像（Rs-fMRI）技术分析两组间脑功能差异。低频振幅（ALFF）与功能连接（FC）作为两种独立的fMRI检测方法，分别用于解析体素水平局部神经活动特征与体素水平功能整合特性。通过计算特定脑区所有体素的平均值，可量化该脑区的功能连接特征。此研究构建了 ALFF 与FC图，以评估糖尿病大鼠静息态脑活动的脑区特异性改变。正常对照组（NC）大鼠的基底前脑（BF）、二级体感皮层（S2）、初级运动皮层（M1）及二级运动皮层（M2）的 ALFF 值均显著高于糖尿病模型组（经FDR校正后，T值>3.6862，p<0.001）（图3a及表2）。
接下来，以显著 ALFF 脑区（M2）作为种子点，报告了全脑功能连接（图3b，表2）。当使用M2作为种子点时，DM组中初级视觉皮层和次级视觉皮层与M2显示出更高的相关性。根据功能磁共振成像（fMRI）数据，计算了感兴趣脑区（M1、M2、S1、S2、丘脑、下丘脑、导水管周围灰质）时间序列间的皮尔逊相关系数。两组中PAG与Tha之间的相关性（r > 0.7）显著高于其他脑区（图3c，d）。为探究DM对功能连接的影响，比较了DM组与NC组大鼠的功能连接。NC组大鼠下丘脑与皮层之间的相关性趋势高于DM组（p < 0.05，未校正）。
图3糖尿病（DM）大鼠与正常对照（NC）大鼠低频波动幅度（ALFF）的比较，DM组与NC组各N=12只。
3.3.两组大鼠反射性排尿期间的脑激活
大量神经活动常导致全脑范围内原始图像强度的全局性增强，与膀胱空虚状态相比，这会引起膀胱收缩时的全脑激活。排尿过程中，糖尿病大鼠表现出胼胝体、丘脑、齿状回、导水管周围灰质、次级扣带回皮层、初级扣带回皮层、初级运动皮层大脑皮层、次级运动皮层及下丘脑的显著激活（图4a及表3）。正常对照组则表现为基底前脑与下丘脑的激活（图4b及表3）。两组间脑激活比较显示，糖尿病大鼠在丘脑、齿状回、上丘、胼胝体、次级扣带回皮层、初级运动皮层、次级运动皮层及腹侧被盖区（PAG）表现出更强的激活强度（FDR p < 0.05）（图4c及表3）。此外，静脉注射 NLX -112后，糖尿病大鼠初级体感皮层激活程度显著增强（p < 0.001，团块大小>5个体素，未校正）；但 NLX -112检验未通过多重比较检验。
表1 | 正常对照组大鼠与糖尿病大鼠的特征
4.讨论
随着糖尿病发病率的急剧上升，常见泌尿系统并发症如糖尿病膀胱功能障碍也相应增加。链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠被广泛用作糖尿病膀胱功能障碍的啮齿动物模型。在此研究中，糖尿病动物的膀胱容量在12周时显著增加，保持在约1.65 mL或高于对照值150%。胶原构成下尿路细胞外基质的主要成分，其中I型和III型是影响其生物学功能的主要亚型。I型胶原赋予组织抗张强度，而III型胶原通常与特定基质中的横纹纤维相关。因此，I型/III型胶原比值可作为组织抗张强度的指标。此研究的发现显示I型/III型胶原比值显著降低，这可能与糖尿病诱导的各种细胞外基质相关基因的下调有关。这些发现与先前实验室动物中的报道相似。
越来越多的证据表明，大脑是糖尿病终末器官损伤的部位。糖尿病与认知障碍和功能衰退相关。尽管糖尿病脑功能障碍的发病机制尚不完全清楚，但研究表明高血糖诱导动脉僵硬、神经炎症、血脑屏障改变和神经递质失衡，导致脑功能受损。先前的研究已证明，与对照组相比，糖尿病动物特定脑区（尤其是大脑皮层）的神经活动减少。其他脑区，如纹状体、尾壳核、海马和岛叶，在不同研究中也显示出功能损害。
此研究观察到糖尿病大鼠大脑皮层和基底前脑的低频振幅显著降低。基底前脑在糖尿病相关的磁共振成像研究中很少被提及，结果的差异可能是由于样本量小和糖尿病分期不同所致。先前的研究表明，基底前脑在认知和记忆功能中发挥重要作用，该脑区的异常与多种神经退行性疾病相关。流行病学上，糖尿病与阿尔茨海默病和帕金森病的患病率增加相关。此研究中观察到的基底前脑病理生理变化提示，使用静息态功能磁共振成像技术分析的低频振幅可作为糖尿病动物模型异常神经活动的影像生物标志物。这一策略可能有助于进一步理解糖尿病相关的神经退行性疾病，值得进一步研究。
表2 | 糖尿病（DM）与正常对照（NC）大鼠静息态功能磁共振成像（fMRI）结果汇总
近期静态功能连接研究致力于理解糖尿病个体脑功能障碍的神经机制。在糖尿病前期，人类和动物研究均报道功能连接增加，这可能表明对脑体积减少的代偿机制。在晚期糖尿病中，尤其是在认知障碍患者中，大多数研究显示功能连接显著降低。在特定脑区之间的连接中观察到损害，包括双侧舌回和感觉运动皮层、尾状核和中央前回、海马和杏仁核。此外，在一些文献中，丘脑对糖尿病脑功能连接功能障碍有很大贡献，这与此研究的研究相似。这些结果可能有助于更好地理解糖尿病引起的中枢神经系统变化。通过基于种子点的功能连接，此研究观察到糖尿病组中次级运动皮层与视觉皮层之间的功能连接增加——这是一个在糖尿病文献中未见报道的新发现。虽然在糖尿病神经病理学中未见此关联报道，但功能性肌张力障碍的研究已证明联合视觉网络与运动脑区之间的异常通信，提示视觉运动整合受损可能损害运动协调。此研究假设慢性高血糖可能诱导这些跨模态通路内的细微神经变性或适应性重连，可能导致次级运动皮层-视觉皮层连接的优先增强，作为对感觉运动功能障碍的代偿机制或病理性适应。
图4 | 排尿诱发的大脑BOLD正向激活，糖尿病（DM）组与正常对照（NC）组大鼠样本量N=7。显著脑区根据其T值进行着色标示。冠状切面显示从尾侧至吻侧的解剖结构，脑部顶部朝上。
先前的研究使用等容膀胱收缩通过功能磁共振成像检查大鼠的脑控制。这些收缩可能代表进入中枢神经系统的最大膀胱传入输入，但由于结扎引起的尿道梗阻和膀胱扩张，其生理性较低。此研究采用连续膀胱测压来研究大脑对下尿路的控制。与等容收缩不同，连续灌注诱导的排尿更具生理性，因为尿道保持通畅。然而，膀胱充盈时间不足以采集高分辨率数据来检测神经活动。因此，此研究的分析聚焦于反射性排尿期间的脑激活。为了提高时间分辨率，此研究使用尿动力学测试将膀胱灌注期分为排尿期和储尿期，这是评估下尿路症状的重要方法。
基于先前的神经影像学发现，当前的下尿路上脊髓控制模型表明，来自下尿路的上行信号通过导水管周围灰质、脑桥排尿中枢和丘脑中继到参与决策和行动执行过程的皮层脑区。控制排尿的皮层脑区具体包括岛叶、前额叶皮层、前扣带皮层和其他脑区。此研究的研究表明，大鼠的膀胱收缩触发的脑激活变化与先前研究中在大膀胱容量下观察到的变化相似，特别是在导水管周围灰质和丘脑中。此研究在连续膀胱测压期间未检测到脑桥排尿中枢激活，这与先前的研究发现一致，即脑桥排尿中枢激活效应量较小，即使使用感兴趣区分析也难以检测到。
在此研究中，与正常对照组相比，糖尿病膀胱功能障碍大鼠在丘脑、齿状回、上丘、胼胝体、次级扣带皮层、初级运动皮层、次级运动皮层和导水管周围灰质表现出更强的激活。文献表明，初级运动皮层通过投射到脑桥排尿中枢在排尿的下行控制中起关键作用，而胼胝体发育不全与低收缩性神经源性膀胱相关。此研究推测，糖尿病膀胱功能障碍大鼠较大的膀胱容量导致导水管周围灰质和丘脑活动增加。然而，岛叶未显示出触发排尿反射的强信号，导致初级运动皮层和其他脑区出现代偿性的更强活动。临床前证据表明，5-HT₁A受体激动剂如NLX-112可改善糖尿病膀胱功能障碍模型中的排尿效率。值得注意的是，一项药理学磁共振成像研究揭示，NLX-112在视前大细胞核和压后皮层引起强烈的血氧水平依赖信号增强，同时伴有眶额皮层和脑干的显著活动减退，且在测试浓度中以剂量依赖性方式递增。在此研究中，初级躯体感觉皮层显示出更强的激活，但多重比较未通过。这可能是由于样本量小，或糖尿病大鼠背外侧核中5-HT₁A受体上调所致，提示该药物可能在大脑外有更多作用。
表3 | 反射性排尿期间脑激活区域汇总。
此研究有几个局限性。首先，涉及膀胱功能的神经回路复杂且分布广泛。虽然某些脑区（如脑桥排尿中枢）与膀胱功能密切相关，但这些脑区的效应量较小，导致在功能磁共振成像扫描中无法检测到显著激活。另一个局限性是使用乌拉坦麻醉。虽然它是维持排尿反应的最佳可用麻醉剂，但它会损害膀胱功能。另一方面，麻醉最小化了其他脑过程（如注意和情绪）的影响，而这些过程也可能影响排尿功能。
5.结论
此研究利用功能磁共振成像结合连续膀胱测压，检测了糖尿病膀胱功能障碍大鼠的脑活动，以探索与该疾病晚期相关的神经改变。结果显示，在尿液储存期，糖尿病大鼠的大脑皮层和基底前脑活动降低。然而，在排尿期，这些大鼠在多个关键脑区（包括导水管周围灰质、丘脑、初级运动皮层和胼胝体）表现出活动增强。这些发现为中枢神经系统在晚期糖尿病膀胱功能障碍病理生理学中的作用提供了有价值的见解，可能为理解和治疗该疾病开辟新的研究方向。
解读：脑海科技
参考文献
Li M, Chen X, Ye J, et al. Functional MRI Analysis of Brain Activity in Rats With Diabetic Bladder Dysfunction. CNS Neurosci Ther. 2025;31(6):e70466. doi:10.1111/cns.70466
