摘要：MSC-EV相关研究和转化应用持续推进，但上游生产的规模化放大仍然是工艺开发中的重要问题。本研究基于无动物源MSC及配套培养基体系，采用微载体-搅拌罐生物反应器工艺，在250 mL规模完成关键工艺参数优化后，将工艺进一步放大至15 L。结果显示，放大后的EV颗粒产量、粒径分布、经典EV标志物以及体外生物功能与250 mL体系具有较好的可比性，为MSC-EV从小规模工艺开发向更大体积制造体系转移提供了参考。
关键词：外泌体、细胞外囊泡、MSC-EV、规模化生产、搅拌罐生物反应器、微载体、关键工艺参数、CPP、关键质量属性、CQA、RoosterBio
2023 ISEV年会上，RoosterBio与Sartorius Stedim North America联合发布学术海报《Successful development of a scalable and robust process for MSC-EV production》，介绍了一套基于微载体-搅拌罐生物反应器的hMSC-EV生产工艺。研究首先在250 mL规模评估和优化关键工艺参数（CPP），随后将确定的工艺条件放大至15 L Biostat STR进行验证，并进一步比较两个规模之间的细胞扩增、EV颗粒产量、粒径、标志物和生物功能等关键质量属性（CQA）。
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）是多种类型细胞释放的纳米级脂质双层颗粒，内部可携带蛋白质、RNA、DNA以及脂质等生物货物。随着MSC来源EV相关研究不断发展，上游生产需要面对一个越来越现实的问题：如何从实验室规模逐步扩大到更高产量体系，同时避免MSC状态、EV产量和质量属性随着规模发生明显漂移。这项研究正是围绕这一工艺放大问题展开。RoosterBio MSC和EV相关培养体系资料可参考RoosterBio MSC与MSC-EV技术资料。
一、背景：MSC-EV规模化生产需要同时解决细胞、产量和质量问题
EV生产从小规模走向更大规模时，不能仅依靠增加二维培养面积解决，因为MSC本身属于贴壁依赖细胞，培养面积扩大意味着更多培养容器、培养基、人工操作和批次差异。微载体-搅拌罐体系通过在反应器内部提供大量细胞附着表面积，使MSC能够在动态环境中扩增，为规模化上游生产提供另一种实现路径。
与此同时，MSC-EV工艺的目标并不只是获得更多颗粒。大规模体系还必须保持与小规模相似的MSC生长表现，并确认最终EV颗粒的数量、粒径、膜结构、标志物和功能没有发生明显变化。因此，这项研究先利用小规模体系建立CPP，再通过15 L放大验证CQA是否保持可比。
二、研究设计：250mL小试开发与15L放大验证
2.1 主要物料：MSC、扩增培养基和EV收集培养基
本研究以无动物源人骨髓MSC Rooster Vial-hBM作为生产细胞来源，使用Rooster Nourish培养基在Ambr 250系统中进行MSC扩增。进入EV分泌和收集阶段后，培养体系切换至低颗粒EV收集培养基Rooster Collect-EV。整个流程采用微载体和搅拌罐生物反应器体系完成，从而将MSC扩增和EV收集连接为一个连续上游生产流程。
2.2 开发与验证策略：先优化CPP，再比较放大后的CQA
研究采用“小规模开发、大规模验证”的两步策略。在250 mL系统中，主要评估微载体类型、MSC扩增时长、微载体密度、初始细胞接种密度以及EV收集时间等关键工艺参数。完成小规模筛选之后，再将确定的CPP转移到15 L生物反应器中进行验证。
与此同时，研究还评价了多个关键质量属性，包括颗粒数量和粒径、经典EV标志物、脂质膜颗粒比例以及生物效价，从而判断放大之后得到的EV条件培养液是否与小规模体系保持较好的可比性。
图1：RoosterBio MSC-EV生产工艺流程图。
三、250mL工艺开发：确定微载体、细胞密度和培养时间窗口
在250 mL系统中，研究团队对多个CPP进行了系统评价。微载体筛选结果显示，Synthemax II微载体可获得约80%的MSC贴壁率，因此进入后续实验；MSC生长在培养第5天达到峰值后趋于稳定，因此将5天确定为MSC生长阶段时长；微载体密度设置为3X能够提高细胞产量；1X细胞接种密度已经可以获得较高细胞产量，同时不会引起明显的细胞/微载体聚集；进入EV收集阶段并切换至Rooster Collect-EV之后，颗粒产量持续提高，并在收集阶段第5天达到峰值，因此EV收集时间同样确定为5天。
采用以上优化参数之后，250 mL体系在收获日可稳定获得可比的细胞数量以及约1–1.5×10¹⁰ particles/mL的EV颗粒产量，同时两个不同供者以及3个独立批次之间均表现出较好的重复性。
图2：小规模工艺开发结果——供者间和批次间一致性。
| 参数 | 优化结果 |
|---|---|
| 微载体类型 | Synthemax II（Corning） |
| 微载体密度 | 3X |
| 细胞接种密度 | 1X |
| MSC生长时长 | 5天 |
| EV收集培养基 | Rooster Collect-EV |
| EV收集时长 | 5天 |
表1：250mL开发优化的部分关键工艺参数
四、15L放大验证：细胞密度和EV颗粒产量保持可比
15 L生物反应器中的整体工艺包括种子扩增4天、MSC生长阶段5天和EV收集阶段5天，并继续使用1X细胞接种密度和3X微载体密度。在MSC生长阶段结束之后，培养体系更换为EV收集培养基并进入颗粒收集。
放大结果显示，15 L体系中的MSC在生长阶段第5天达到约4E5 cells/mL，与250 mL体系结果相当；EV收集阶段第5天，颗粒产量达到约1.7×10¹⁰ particles/mL，同样与小规模阶段获得的1–1.5×10¹⁰ particles/mL具有较好的可比性。细胞生长和颗粒收集两个维度均没有因规模从250 mL扩大到15 L而出现明显下降。
图3：15L放大验证——细胞生长与颗粒收集结果。
五、CQA评价：从颗粒数量进一步观察身份、粒径和功能
研究没有仅用颗粒数量判断工艺是否放大成功，而是使用多种方法对收获物进行表征。NTA和荧光膜染色结果显示，在检测到的纳米颗粒中约91%的颗粒对MemGlow脂质膜染料呈阳性，提示大部分颗粒具有脂质膜结构特征。
图4：颗粒完整性分析。
不同生产规模和不同收集时长条件下，颗粒粒径分布保持一致，说明250 mL和15 L体系之间没有出现明显的粒径群体漂移。
图5：EV粒径分布。
在EV相关蛋白检测方面，收获的条件培养基中检出了四跨膜蛋白CD63、CD9和CD81，同时检测到TSG101，两个生产规模之间的表现差异不大。研究还通过多种独立分析方法对颗粒进行交叉确认，为脂质双分子层囊泡特征提供进一步证据。
功能评价方面，研究使用HUVEC划痕愈合实验测试15 L Biostat STR收获的EV条件培养基。结果显示，该条件培养基对应的伤口闭合表现优于未条件化培养基阴性对照，并与生长培养基阳性对照相当。
图6：HUVEC划痕愈合效力。
六、研究结论：MSC-EV放大需要同时证明工艺和质量可比
本研究建立了一套微载体-搅拌罐hMSC-EV生产流程，以Rooster Vial-hBM无动物源人骨髓MSC为生产细胞，配合Rooster Nourish MSC扩增培养基和Rooster Collect-EV低颗粒收集培养基，在250 mL规模完成工艺开发，再进一步将工艺扩大至15 L Biostat STR。
从研究结果来看，250 mL和15 L体系在MSC细胞生长、单位体积EV颗粒产量、粒径分布、经典EV标志物以及体外划痕愈合功能等方面保持了较好的可比性。这说明，通过先建立小规模CPP，再利用CQA验证大规模体系的方式，可以为MSC-EV上游生产的工程化放大提供较清晰的开发路径。
对于实际MSC-EV药物或工艺研发而言，这项研究更值得借鉴的是“高质量起始细胞+匹配的MSC扩增/EV收集培养体系+微载体搅拌罐+CPP/CQA评价”的整体思路，而不是直接复制某一个具体参数。不同细胞来源、设备和培养体系仍需要重新建立自身工艺窗口。
| 产品名称 | 在本工艺中的作用 |
|---|---|
| Rooster Vial-hBM | 无动物源人骨髓MSC（xeno-free hBM MSC），作为EV生产细胞来源 |
| Rooster Nourish | MSC扩增培养基，用于250mL及15L间充质干细胞扩增 |
| Rooster Collect-EV | 低颗粒EV收集培养基，用于EV收集阶段 |
表2：本研究使用的RoosterBio产品
关于RoosterBio相关MSC-EV培养体系
RoosterBio的MSC和EV相关体系覆盖MSC细胞来源、扩增以及EV收集等上游培养环节。本研究中实际使用的是Rooster Vial-hBM、Rooster Nourish和Rooster Collect-EV三类产品，分别对应生产细胞来源、MSC扩增阶段和EV收集阶段。对于正在建立微载体或搅拌罐MSC-EV工艺的研究团队，可将细胞来源、扩增培养环境和收集阶段作为一个连续体系进行评价，而不是将各环节完全割裂。
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关于技术来源
本文基于RoosterBio与Sartorius公开的2023 ISEV MSC-EV规模化生产海报及相关技术资料，曼博生物整理，仅用于科研信息分享和实验工艺参考。本文涉及的Synthemax II微载体、3X微载体密度、1X细胞接种密度、5天MSC扩增、5天EV收集、1–1.5×10¹⁰ particles/mL以及15 L约1.7×10¹⁰ particles/mL等数据均来源于该研究的特定实验体系，实际应用时应结合MSC来源、生物反应器、培养基、搅拌条件、EV纯化方法和分析体系进行重新验证。
本文围绕RoosterBio、Rooster Vial-hBM、Rooster Nourish、Rooster Collect-EV、MSC-EV、微载体生物反应器、CPP、CQA、EV质量表征和规模化生产等方向整理相关公开技术信息。
