热稳定性分析（Thermal Shift Assay, TSA）该方法亦被称为差示扫描荧光法（Differential Scanning Fluorimetry, DSF），其原型理念源于蛋白质化学中对蛋白质稳定性的研究。随着实时荧光定量PCR（qPCR）仪的普及和专用荧光染料的开发，TSA凭借其惊人的简易性、低成本和高通量优势，迅速成为制药公司及学术实验室在药物筛选中不可或缺的“守门员”技术。
01实验原理
在天然蛋白质中，其内部的疏水区域被紧密折叠包裹。此时，SYPRO Orange染料在水溶液中荧光信号极弱。然而，当蛋白质在加热过程中开始变性、结构松散时，原本隐藏的疏水内核会暴露出来。SYPRO Orange能迅速结合这些暴露的疏水斑块，一旦结合，其荧光强度会激增数百倍。
图1 TSA实验原理图（来自网络）。
（1）将蛋白质与SYPRO Orange染料混合。
（2）在实时荧光定量PCR仪中，对样品进行缓慢而均匀的升温（例如，从25°C升至95°C）。
（3）仪器持续监测荧光强度。初始阶段荧光很低，随着温度接近蛋白质的变性点，结构大规模展开，染料大量结合，荧光信号陡然上升。
（4）最终得到一条熔解曲线，其拐点所对应的温度即为熔点（Tm），它精确代表了蛋白质的热稳定性。
如果向蛋白质中加入能与之特异性结合的小分子（如药物候选化合物），该分子往往会像“分子胶”一样稳定蛋白质结构，使其更耐热。这会导致熔解曲线向右移动，即测得的Tm值升高。通过这种简单的Tm值偏移，研究人员就能快速判断小分子是否与目标蛋白结合，从而高通量地筛选药物或优化蛋白质制剂。
02结果解读
Lynn等人通过TSA技术来研究目标蛋白POT1与寡核苷酸分子结合验证，在单独POT1蛋白和POT1+阴性分子（不与POT1结合的分子）的荧光峰值出现在50°C附近；而加目标分子寡核苷酸O1后，荧光峰值出现在了65°C附近，Tm值发生了偏移。说明加目标分子寡核苷酸O1后，使目标蛋白POT1结构更加稳定且耐热，两者存在互作可能性。
图2 TSA结果解读（DeLeeuw et al., 2021）。
参考文献
DeLeeuw L W, Monsen R C, Petrauskas V, et al. POT1 stability and binding measured by fluorescence thermal shift assays[J].PLoS One, 2021, 16(3): e0245675.
